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1、第十九章 色谱法导论 generalization of chromatograph analysis,第一节 概述,色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法，特别适宜于分离多组分的试样，是各种分离技术中效率很高和应用最广的一种方法。 它是利用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。,第一节 概述,一、色谱法的起源和发展 俄国植物学家M.Tswett于1906年首次提出色谱法。 固定相(stationary phase)：填入玻璃柱内静止不动的一相(固体或液体)。 流动相(mobile phase)：自上而下流动的一相(液体、气体
2、或超临界流体)。 色谱柱(chromatographic column)：装有固定相的柱子。,固定相CaCO3颗粒 流动相石油醚,第一节 概述,1906 色谱法 1930 离子交换色谱法（IEC) 1938 薄层色谱法(TLC) 1941 分配色谱法(LLC) 1944 纸色谱(PC) 1952 气相色谱法(GC) 1959 凝胶色谱 (GPC) 1968 高效液相色谱法 (HPLC) 1988 超临界流体色谱(SFC),第一节 概述,二、色谱法的分类 （一）按两相状态分类 按流动相的状态分类 ： 气相色谱法(GC)：用气体作为流动相的色谱法 液相色谱法(LC)：用液体作为流动相的色谱法 超临
3、界流体色谱法(SFC)：以超临界流体作为流动相的 色谱法 按固定相的状态分类： 气相色谱法分：气-固色谱法(GSC)和气-液色谱法(GLC) 液相色谱法分：液-固色谱法(LSC)和液-液色谱法(LLC),第一节 概述,（二）按分离机理分类 吸附色谱法：利用物理吸附性能的差异 分配色谱法：利用分配系数的不同 离子交换色谱法：利用离子交换原理 尺寸排阻色谱法：利用分子在固定相中的选择渗透 （三）按操作形式分类 1.柱色谱法 填充柱色谱 毛细管柱色谱 纸色谱法 2.平面色谱法 薄层色谱法 薄膜色谱法,第二节 色谱流出曲线及有关术语,一、色谱流出曲线（色谱图 ） 二、基线 当色谱柱后没有组分通过检测器
4、时，仪器记录到的信号。 三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离称为色谱峰高，用h表示。,第二节 色谱流出曲线及有关术语,四、色谱峰区域宽度 用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法： （1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽。W1/2=2.355 （3）基线宽度(W)：色谱峰两侧拐点上切线在基线上截距间的距离。 W=4 ,第二节 色谱流出曲线及有关术语,五、拖尾因子 计算公式： T=W0.05h/2d1 拖尾因子用于衡量色谱峰的对称性。 T应在0.951.05之间，此时色谱峰为对称峰。,第二节 色谱流出曲线及有关术语,六、保留值
5、 （一）保留时间 保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间； 死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间； 调整保留时间（tR ）： tR= tRtM,第二节 色谱流出曲线及有关术语,(二) 保留体积 保留体积（VR）： VR = tRFc Fc为柱出口处的载气流量，单位：m L / min。 死体积（VM ）： VM = tM Fc 调整保留体积(VR)： V R = VR VM,第二节 色谱流出曲线及有关术语,（三）相对保留值ri，s 某一组分i的调整保留值与标 准物s的调整保留值之比，称为组 分i对标准物s的相对保留值ri，s ri，s = tRi /
6、tR s = VRi / VR s 相对保留值只与柱温和固定 相性质有关，与其他色谱操作条 件无关，它表示了固定相对这两 种组分的选择性。,第二节 色谱流出曲线及有关术语,色谱流出曲线上重要信息： （1）据色谱峰的个数，可以判断试样中含组分的最少个数。 （2）根据色谱峰的保留值，可以对组分进行定性分析。 （3）根据色谱峰的面积或峰高，可以对组分进行定量分析。 （4）利用色谱峰的保留值及区域宽度，可评价柱效。 （5）根据色谱峰间的距离，可评价色谱条件的选择是否合理。,第二节 色谱流出曲线及有关术语,七、分配系数和容量因子 （一）分配系数(K) 分配系数是在一定温度和压力 下，组分在固定相和流动相
7、中 平衡浓度的比值， 用K表示 ： K= Cs/ Cm Cs组分在固定相中的浓度， Cm组分在流动相中的浓度,第二节 色谱流出曲线及有关术语,（二）容量因子（k） 在一定温度和压力下，两相平衡时，组分在两相中的质量比，用k表示 ： k= ms/ mm ms为组分在固定相中的质量，mm为组分在流动相中的质量。,第二节 色谱流出曲线及有关术语,八、容量因子与保留因子（R）的关系 R=溶质在流动相中分子数/溶质分子总数 tR = tM/R=tm(1+ k ) 此式说明在给定的条件下，容量因子（ k ） 越大，或保留因子（R）越大，溶质的保留时 间（tR）越长。,第三节 色谱法基本理论,一、塔板理论-
8、柱分离效能指标 1.塔板理论（四点假设 ） 塔板理论是把色谱柱假想成一个精馏塔，在柱内一小段长度内组分可达平衡，H为理论塔板高度。 流动相每次进样一个塔板体积； 在每个塔板上，组分在两相间瞬时达成一次分配平衡； 分配系数在所有塔板上都是常数。,第三节 色谱法基本理论,色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为： 因而n或H可作为描述柱效能的指标，高 柱效有大的n值和小的H值。,第三节 色谱法基本理论,2.有效塔板数（n有效）和有效塔板高度（H有效） 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 用不同物质计算
9、可得到不同的理论塔板数。 组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效 塔板数和有效塔板高度：,第三节 色谱法基本理论,3.塔板理论的特点和不足 （1）塔板理论在解释流出曲线的形状、浓度极大 点的位置及计算评价柱效等方面都取得了成功。 （2）塔板理论是半经验性理论，它的某些假设不 完全符合色谱的实际过程。例如，纵向扩散是不能忽 略的，色谱过程也不可能达到真正的平衡状态。 （3）它只能定性地给出塔板高度的概念，不能找 出影响塔板高度的因素，也不能解释峰形展宽(扩张) 的原因。,第三节 色谱法基本理论,二、速率理论-影响柱效的因素 1. 速率方程（也称范.弟姆特方程式） H = A + B/u +
10、Cu H：理论塔板高度， u：载气的线速度(cm/s) 减小A、B、C三项可提高柱效； 存在着最佳流速； A、B、C三项各与哪些因素有关？,A涡流扩散项 A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A， H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽 现象减轻，色谱峰较窄。,B/u 分子扩散项 B = 2 Dg ：弯曲因子， 填充柱色谱，1。 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s ） (1) 存在着浓度差，产生纵向扩散; (2) 扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差; (3) 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间， 扩散;
11、(4) 扩散系数：Dg (M载气)-1/2 ； M载气， B值。,-1,Cu 传质阻力项 传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL 即： C =（Cg + CL）,k为容量因子； Dg 、DL为扩散系数。 减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。,2.载气流速与柱效 载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效 的主要因素，流速，柱效。 载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效 的主要因素，流速,柱效。 H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效 的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式 中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。,以塔板高度H对应载气
12、流速u作图，曲线最低点 的流速即为最佳流速。 当为最佳时，要使H足够小，还与A、B、C三项 中各参数有关，只有A、B、C较小时，H才能小、柱 效才会高。 载气最佳流速为： uopt=,第三节 色谱法基本理论,三、分离度 分离度是指相邻两组分保留时间之差与两组分 基线宽度平均值的比值，用R表示 R= = tR1,tR2分别为相邻两组分的保留时间， W1、W2分别为两组分峰宽。 通常用R1.5，作为相邻两组分完全分离的标志。,第三节 色谱法基本理论,色谱分离中的四种情况如图所示： 柱效较高，K(分配系数)较大,完全分离； K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离； 柱效较低，K较大,但分离的不
13、好； K小，柱效低，分离效果更差。,四、色谱分离方程式 分离度R的定义并没有反映影响分离度的因 素。实际上，分离度还受柱效（n），选择因子 （）和容量因子（k）三个参数的控制。 选择因子是指难分离物质对的调整保留值之比。,第三节 色谱法基本理论,第三节 色谱法基本理论,整理后得色谱分离基本方程式： 或 (a) (b) (c) (a)项为柱效项，（b）项为柱选择项，(c) 项为容量因子项，分离度与 (a)、 (b) 、(c)三 项有关。,第三节 色谱法基本理论,（一）分离度（ R ）与柱效（ n ）的关系 分离度与n的平方根成正比，增加柱长可改 进分离度，可见用较长的柱可以提高分离度，但 延长了分离时间，将引起峰扩张。,第三节 色谱法基本理论,（二）分离度（ R ）与选择因子（）的关系 当=1时，R0，两组分是无法分离的。 显然大，选择性好，两组分容易分离。如值 为1.10时，获得分离度为1.0的色谱柱的有效理 论塔板数为1900，但是增至1.15，在同一柱的 上的分离度就可超过1.5以上。,第三节 色谱法基本理论,（三）分离度（ R ）与容量因子（k）的关系 容量因子k值增大时，对R有利。当k10 时，k/k+1的改变不大，对R改进不明显，故k值 最佳范围是1k10，这样，既可得到较大的R 值，又可减少分析时间和峰的扩展。,