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1、本科毕业设计（论文）奶制品氮含量测定技术的研究李宁燕山大学里仁学院2013年 6月 本科毕业设计（论文）奶制品氮含量测定技术的研究学 院： 里仁学院 专 业： 应用化学 学生 姓名： 李宁 学 号： 091610021037 指导 教师： 李阿丹 答辩 日期： 2013年6月16日 燕山大学毕业设计（论文）任务书学院：里仁学院 系级教学单位：建环系 学号091610021037学生姓名李宁专 业班 级应用化学09-2班题目题目名称奶制品氮含量测定技术的研究题目性质1.理工类：工程设计 （ ）；工程技术实验研究型（ ）；理论研究型（ ）；计算机软件型（ ）；综合型（ ）2.文管理类（ ）；3.外
2、语类（ ）；4.艺术类（ ）题目类型1.毕业设计（ ） 2.论文（ ）题目来源科研课题（ ） 生产实际（ ）自选题目（ ） 主要内容利用凯氏定氮法，双缩脲法，考马斯亮蓝法以及反相高效液相色谱法对牛奶以及掺杂尿素和三聚氰胺的牛奶进行检测，对比分析这几种方法的优缺点，从中找出最适合的蛋白质测定的方法。基本要求掌握各种检测方法的基本原理，明确每种检测方法的基本内容，熟练掌握分光光度计，高效液相色谱仪等仪器的使用方法。参考资料中国期刊数据库蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定奶制品中蛋白质测定方法相关文献周 次第1 4周第510周第1113周第1416周第1720周应完成的内容查阅相关文献，了解奶制
3、品中氮含量的测定方法，提交文献综述。实验阶段，用凯氏定氮法、Bradford法、双缩脲法和反相高效液相色谱法测定牛奶及掺杂的牛奶进行检测分析。对试验数据进行处理计算。分析比较几种方法，并提出自己的看法。撰写毕业论文，提交论文。指导教师：李阿丹职称：副教授 2013年6月16日系级教学单位审批： 年 月 日摘要本文采用凯氏定氮法，双缩脲法，考马斯亮蓝法以及反相高效液相色谱法分别对牛奶以及掺入尿素和三聚氰胺的牛奶样品进行实验分析，并对几种方法测得的进行比较。在双缩脲法和考马斯亮蓝法中对样品的前处理时选用的是有机溶剂沉淀法，使用乙腈提取牛奶中的蛋白质。高效液相色谱法是用的反相色谱法，使用ZORBAX
4、300SB-C18色谱柱（250 mm 4.6 mm，5 m）和紫外检测器，用标准添加法对纯牛奶样品中的尿素和三聚氰胺的含量进行了检测分析。通过对结果的分析以及对比可知，用凯氏定氮法测得的氮含量是牛奶中的总氮含量，该方法消耗时间长，操作繁琐。用双缩脲法和考马斯亮蓝法要比凯氏定氮法简便迅速，并且这两种方法也都可以快速准确的检测出蛋白质的含量。用反相高效液相色谱法测定时待测样品在出峰处不会受到牛奶中其它组分的干扰，因此可用于奶制品中尿素和三聚氰胺含量的准确检测与分析。关键词牛奶蛋白质；凯氏定氮法；双缩脲法；考马斯亮蓝法；反相高效液相色谱法；有机溶剂沉淀法 燕山大学本科生毕业设计（论文）Abstra
5、ctIn this paper, the Kjeldahl method, biuret method, Coomassie brilliant blue method and high performance liquid chromatography(HPLC), respectively, for milk and milk mixed with urea and melamine test samples analyzed and measured by several methods for comparison. In the biuret method and Coomassie
6、 brilliant blue method for sample pre-treatment of choice is an organic solvent precipitation method using acetonitrile extract the protein in milk. HPLC with reversed-phase chromatography using ZORBAX300SB-C18 column (250 mm 4.6 mm, 5 m) and a UV detector, using standard addition method for pure mi
7、lk sample content of urea and melamine the detection and analysis.Through analysis and comparison of results shows that, with the Kjeldahl nitrogen content measured by the total nitrogen content of the milk, the method consumes a long time and complicated operation. With the biuret method and Coomas
8、sie blue staining than Kjeldahl method is simple and rapid, and these two methods can also be quickly and accurately detect the protein content. By reversed-phase high-performance liquid chromatography peaks when the sample in place will not be interference from other components in milk, it can be u
9、sed in dairy products of urea and melamine accurate detection and analysis.Keywords Kjeldahl method; biuret method; Bradford method; Reverse Phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC); organic solvent precipitationIII目 录摘要IAbstractII第1章 绪论11.1 课题背景11.2 蛋白质测定方法概述21.2.1 凯氏定氮法21.2.2 双缩脲法(Biu
10、ret法)31.2.3 福林-酚试剂法（Lowry法）51.2.4 考马斯亮蓝法（Bradford法）61.2.5 高效液相色谱法（HPLC）71.3 课题研究的意义81.4 课题研究的主要内容9第2章 实验材料及方法102.1 用凯氏定氮法测定牛奶中的蛋白质含量102.1.1 实验仪器及药品102.1.2 实验操作及步骤102.2 双缩脲法测定牛奶中的蛋白质含量122.2.1 实验仪器及药品122.2.2 实验操作及步骤122.3 考马斯亮蓝法测定牛奶中的蛋白质含量152.3.1 实验仪器及药品152.3.2 实验操作及步骤152.4 反相高效液相色谱法测定牛奶中的三聚氰胺及尿素的含量182
11、.4.1 实验仪器及药品182.4.2 实验操作及步骤18第3章 实验结果与分析213.1 凯氏定氮法的实验数据处理及结果分析213.1.1 实验数据及处理213.1.2 实验结果及分析223.2 双缩脲法的实验数据处理及结果分析223.2.1 样品掺杂处理中所需尿素和三聚氰胺溶液的浓度计算223.2.2 标准蛋白曲线的绘制223.2.3 双缩脲法对掺杂尿素溶液的未知样品溶液中的蛋白质含量的测定233.2.4 双缩脲法对掺杂三聚氰胺的未知样品溶液中的蛋白质含量的测定253.3 考马斯亮蓝法的实验数据处理及结果分析263.3.1 样品掺杂处理中所需尿素和三聚氰胺溶液的浓度计算263.3.2 标准
12、蛋白曲线的绘制263.3.3 考马斯亮蓝法对掺杂尿素的未知样品溶液中的蛋白质含量的测定283.3.4 考马斯亮蓝法对掺杂三聚氰胺的未知样品溶液中的蛋白质含量的测定293.4 反向高效液相色谱法的实验数据处理及结果分析303.4.1 尿素标准曲线和三聚氰胺标准曲线的绘制303.4.2 反向高效液相色谱法测样品中的尿素和三聚氰胺33结论36参考文献37致谢40附录1 开题报告41附录2 文献综述44附录3 中文译文47附录4 外文原文56 65第1章 绪论 第1章 绪论1.1 课题背景随着经济的快速发展，人民生活水平的不断提高，以及营养知识的普及和宣传，越来越多的人开始注重在饮食方面的质量，越来越
13、多的人追求营养的均衡发展。蛋白质作为人类最重要的营养物质之一, 是生物体细胞的重要组成成分，有许多的生物学功能。而蛋白质又是牛奶及奶制品中的主要成分，乳蛋白中含有大量的人体必需氨基酸，是人体细胞不可缺少的，也是牛乳中最重要的特征营养成分，因此，作为人们摄取蛋白质的主要来源的奶制品深受人们的青睐。牛奶中的蛋白质含量越高，其营养价值就越高，因此乳及乳制品中蛋白质含量的高低将决定产品的营养价值的高低和质量的优劣。过去几十年中，乳品经常被用作为婴幼儿和老弱病残孕的营养食品，到近些年，乳品已就成为多数人的生活必需品，因此，牛乳的产销量在持续不断的快速增长，同时，乳制品消费量的急剧增大也导致了奶源的严重不
14、足。在这种情况下，在巨大的经济利益的诱惑下，一些不法商贩开始在牛乳中掺杂使假，以从中谋求暴利。乳制品中的掺物的种类有很多种，如：水、米汤、豆浆、淀粉、蔗糖、食盐、碳酸钠、双氧水、电解质溶液、牛尿、尿素、三聚氰胺、植物油、陈乳、白矾、亚硝酸盐、硝酸盐、洗衣粉、抗生素、化肥等1-3。其掺杂的方式也是多种多样的，总结起来有以下几种情况：掺入非蛋白成分(尿素，三聚氰胺，乳脂肪，乳糖等)以使奶制品中的蛋白氮含量增加；掺入杂蛋白(大豆粉，明胶等)以使奶制品中的蛋白质的种类增加；掺入价格低廉的乳源蛋白如乳清粉等以使奶制品的成本降低；掺入其他动物乳汁以降低奶制品的成本。这种在牛乳中掺杂使假的行为不仅极大损害了
15、广大人民群众的身体健康和切身利益，同时也大大降低消费者对乳品企业和乳品质量的信任，甚至使政府在人民心目中的形象遭到破坏。例如2008年的三鹿奶粉事件所造成的后果和社会影响说明，乳品质量好坏与否不仅关系到婴幼儿和青少年的健康成长，也关系到无数家庭的幸福、社会的和谐以及我们国家的形象。虽然这些年来我们国家一直都在不停地打假治假，但是这种掺假造假的现象迄今都是禁而未止，掺杂使假的情况时不时的浮出水面，乳制品的质量安全问题也已经引起了全社会的普遍关注。1.2 蛋白质测定方法概述 蛋白质是乳及乳制品中的主要成分，是牛乳中最重要的特征营养成分，乳及乳制品中蛋白质含量是必测指标4。因此，近年来，人们发展了许
16、多测定蛋白质的方法。目前蛋白质的测定方法主要有凯氏定氮法、分光光度法、和滴定法等5。其中分光光度法又包括：双缩脲法，考马斯亮蓝法，福林-酚试剂法、BCA法和紫外吸收法等，滴定法包括有甲醛滴定法、pH滴定法等。近些年来，色谱技术也开始用于蛋白质含量的检测之中。1.2.1 凯氏定氮法我国国家标准中测定食品中蛋白质(GB/T50095-2003)6有2种方法:凯氏定氮法和比色法。其中，凯氏定氮法是国家标准和国际标准中首推的蛋白质的检测方法。凯氏定氮法（其装置图如下图1-1）的基本原理是将含氮的有机物与浓图1-1 凯氏定氮法消化、蒸馏装置硫酸共同加热,反应过程中样品中的碳、氢等元素被氧化成二氧化碳和水
17、而逸出,有机氮转化为氨,并且进一步与硫酸结合生成硫酸铵，通常称此过程为“消化”。但是这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾来提高反应液的沸点,并加入硫酸铜作为催化剂,以促进反应的进行,指示消化终点的到达。消化之后向消化液中加入浓碱，浓碱可以使消化液中的硫酸铵分解,游离出氨,水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量一定浓度的硼酸溶液中,该过程被称为“碱化蒸馏”。硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子的浓度降低,用标准无机酸滴定吸收后的硼酸溶液,直到恢复溶液中原来氢离子浓度时为止,最后根据所消耗标准酸的当量数即可计算出待测物中的总氮量,再乘以蛋白质系数即为蛋白质的含量7。凯氏定氮法是测定待测样品中总有机氮最准确的方
18、法,也是各种蛋白质含量测定方法的基础。经过科研人员的不断研究和改进8-10,凯氏定氮法已具有应用范围广、灵敏度高、回收率较好、使用仪器设备简单等优点。但是该方法操作消耗时间长,消化一个样品至少需要2个小时,完成整个操作流程一般需要67个小时左右,而且在消化过程中会产生大量的有害气体二氧化硫，污染工作环境,危害操作人员的身体健康。所以该方法一般是在实验室通风性较好的条件下由训练有素的人员来完成11。在我国的国家标准中，凯氏定氮法测定的是总氮的含量，因此得到的结果代表的是乳品中粗蛋白的含量；而在国际标准(ISO，AOAC，IDF)中，先用三氯乙酸对样品进行预处理，使蛋白质沉淀，然后再分别对沉淀中的
19、蛋白态氮和滤液中的非蛋白态氮进行凯氏定氮，测定的结果可真实反映乳品真蛋白的含量12。由于凯氏定氮法操作费时，所以学者们又研究并建立了快速检测蛋白质的方法，即分光光度法，下面将逐一介绍一下常用的几种分光光度法。1.2.2双缩脲法(Biuret法)双缩脲(H2NOCNHCONH2)是两个分子脲在180 左右加热，放出一分子氨后得到的产物。在强碱性溶液（NaOH）中，双缩脲能与铜离子（Cu2+）作用，生成紫红色络合物（该物质的分子结构式见图1-2），该反应即双缩脲反应。图1-2 紫色络合物分子结构式由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应。双缩脲反应
20、是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。具有两个酰胺基或两个直接相连的肽键，或间隔一个碳原子相连的肽键结构的化合物，他们也都可以发生双缩脲反应。肽键是组成蛋白质的基本结构，在碱性环境下，蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成紫红色络合物，且在一定条件下，颜色的深浅程度与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，即蛋白质浓度随着颜色的加深而呈增加的趋势，且成正比关系，而颜色的变化与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，因此我们可以通过双缩脲法比色的方法来测定蛋白质的浓度，这种方法也是常
21、用的方法之一13。双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性的影响较小。而且使用的试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为110 mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5 mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大，干扰此测定的物质有很多。主要的干扰有：酚类、柠檬酸、硫酸铵、Trsi缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用14。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸钠(l%),硝酸钠(l%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液
22、,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会较浅,则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度1-2倍。1.2.3福林-酚试剂法（Lowry法）福林-酚试剂法（Lowry法）是Lowry 在双缩脲方法的基础上发展的。Lowry确定了使用该方法测定蛋白质浓度的基本步骤,他在双缩脲试剂的基础上又增加了一种增强显色的试剂磷钼酸和磷钨酸的混合液,蛋白质中酪氨酸残基的酚羟基会将它们还原，从而产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物),增加显色量,这样就提高了检测蛋白质的灵敏度。Lowry法是最灵敏的蛋白质测定方法之一,该法在生物化学领域得到广泛的应用。（1）实验原理福林-酚试剂法的显色原理是在双缩脲法的基础上12,加入了第二
23、种试剂福林-酚试剂,增加了显色量,从而达到了提高了检测蛋白质的灵敏度的效果。这两种显色反应产生深蓝色的原因是:在碱性环境中,蛋白质中的肽键与铜离子结合生成复合物；福林-酚试剂中的磷铝酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(铝蓝和钨蓝的混合物)。Lowry法中的样品的吸光度取决于一些氨基酸的浓度，同时也取决于叔肽的量，因为两者都会使福林-酚试剂的量减少34，在一定的条件下,蓝色的深度与蛋白的量是成正比的。（2）优缺点Lowry法的优点在于它的灵敏度高,与双缩脲法相比，它的灵敏度要高得多。其缺点有：消耗时间较长,而且要精确的控制操作的时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专
24、一性较差,干扰物质较多。对双缩脉反应发生干扰的离子,同样容易干扰福林-酚反应。而且对后者的影响还要大得多。需要注意的是，在进行测定时,加入福林-酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性条件下稳定,但上述的还原反应只能在pH=10的情况下才可以进行,故当福林-酚试剂加入碱性的铜-蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷铝酸-磷钨酸试剂在遭到破坏之前,还原反应就能发生15。1.2.4考马斯亮蓝法（Bradford法） 由于Biuret法和Lowry法存在着很多的弊端，因此人们开始去寻找更加完善的蛋白质测定方法。Bradford在1976年根据蛋白质与染料相结合的原理设计而建立了考马斯亮蓝法，这种测定蛋
25、白质的方法具有超过其他几种方法的突出的优点,因而得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法16。（1）实验原理由于考马斯亮蓝G-250染料存在着两种不同的颜色形式棕红色和蓝色，在酸性溶液中染料与蛋白质中的芳香族氨基酸和某些碱性氨基酸发生反应,使染料的最大吸收峰的位置(max)由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。在一定的蛋白质浓度范围内(10-1000 g/mL)，蛋白质和染料结合的规律符合比尔定律(Beers Law)17。通过测定在595 nm下的吸光度值A595nm，可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合的过程很快,只需2 min左右即可完全反应,呈
26、现出最大光的吸收,并且稳定时间长达1 h。超过稳定时间之后,蛋白质-染料复合物就会发生聚合并沉淀出来。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数,因此在测定蛋白质时的灵敏度很高18,19。（2）优缺点考马斯亮蓝法的优点在于它的灵敏度高。与福林-酚试剂法相比，考马斯亮蓝法的灵敏度要高四倍左右,其最低的蛋白质检测量可低达10g。这是因为蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料结合后产生的颜色的变化很大,再加上蛋白质-染料复合物又有很高的消光系数,因而吸光度值随蛋白质浓度的变化要比福林-酚试剂法大的多20。Bradford法测定蛋白质含量的另一个优点在于它测定的快速和简便性。完成一个样品的测定, 只需加一种试剂，
27、并且只需要5分钟左右即可。由于考马斯亮蓝G-250染料与蛋白质结合的过程大约只要2分钟就可以完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间时的颜色的稳定性最好，因而Bradford法完全不用像福林-酚法那样费时并且还必须严格地控制时间21。除上述优点之外，Bradford法干扰物质少，如干扰福林-酚试剂法的K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDAT等物质均不会对Bradford法造成干扰22。Bradford法在测定蛋白质含量时也有一些不足之处。由于不同种类的蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量分布不同,因此考马斯亮蓝法在测不同的蛋白质时会有
28、较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用-球蛋白作为标准蛋白以减少这方面的偏差23。另外，Bradford法在测定蛋白质含量时也仍然存在一些物质的干扰,主要的干扰物质有:去污剂、Trtion X-100、十二烷基磺酸钠(SDS)和氢氧化钠24。第三，标准曲线在蛋白质浓度较大时有轻微的非线性,因此不能使用比尔定律直接进行计算,而只能通过标准曲线来测定未知蛋白质的浓度25。除此之外，在测定中, 也会有少部分的蛋白-染料复合物吸附于比色皿的壁上,实验证明这种蛋白-染料复合物的吸附的影响是可以忽略的,实验完毕后用乙醇可以将蓝色的比色皿清洗干净。1.2.5 高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法（High
29、 Performance Liquid Chromatography / HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。高效液相色谱法是在经典的液相色谱法的基础上发展起来的。高效液相色谱法是在高压条件下，溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程，它
30、借溶质在两相间的分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离26。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。高灵敏度：紫外检测器可达0.01 ng，进样量在微升数量级。应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大
31、分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。高效液相色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法。其中，正向色谱法是采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、
32、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。而反向色谱法则一般用非极性固定相（如C18、C8)；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。1.3 课题研究的意义 奶制品已经成为每个家庭的生活必需品，由于中国家庭较多，对奶制品的需求量大，因此有不少厂商为牟取暴利，向奶制品中掺假。在原奶中掺杂掺假27,28，这种丑恶行为既影响了牛奶的品质，又损害了消费者
33、的健康，在社会产生了极大的反响。然而在牛奶中掺入廉价的水解蛋白、其他动物乳或者含氮有机化合物等新的掺假方式，传统的检测方法29-34则难以检出，现在的乳品检测技术往往是等参假物出来后才能确定相对的检测技术，因而不能未卜先知。为此，急需建立适应新掺假情况的快速、准确的检测方法。本实验对牛奶蛋白质进行检验，对牛奶中的蛋白质进行定量检测，为牛奶的掺假检验提供可靠数据，以确保奶制品的质量和安全。本研究的目的是从几种传统的蛋白质测定方法中来寻找适合乳品蛋白质测定的方法。主要选用考马斯亮蓝法(Bradford法) 29,35，双缩脲法31，与凯氏定氮法的结果进行比较，从中找出最适合乳源蛋白质测定的方法。由
34、于福林-酚试剂法对实验时间要求严格，而实验室的设备条件不能达到要求，所以本课题中将不再用此方法进行蛋白质含量的测定。本课题还研究反相高效液相色谱法33对牛乳蛋白和常见的三种可能掺假蛋白质进行定性分析，以期建立有效可行的分析检测乳蛋白成分和牛乳中蛋白质掺假的方法。1.4 课题研究的主要内容 本课题的主要研究内容包括以下几个问题：（1）通过凯氏定氮法准确测定牛奶中的蛋白质的含量。（2）使用双缩脲(Lowry)法、Bradford方法检测牛奶中的蛋白质的含量，并与国标法结果进行比较。（3）使用双缩脲(Lowry)法、Bradford方法对于牛奶中掺入不同比例的尿素溶液、三聚氰胺溶液样品，样品经前处理
35、后，看能否准确测定牛乳蛋白含量。（4）应用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对牛奶中的三聚氰胺和尿素的含量进行测定。 第2章 实验材料及方法2.1 用凯氏定氮法测定牛奶中的蛋白质含量 2.1.1实验仪器及药品实验仪器：凯氏定氮装置、凯氏烧瓶、冷凝管、接收瓶、烧杯、移液管、100 mL容量瓶、量筒、酸式滴定管、分析天平、电热套、研钵、药匙、玻璃棒、胶头滴管、吸管、烧杯和试管若干、铁架台等。实验药品：纯牛奶、96%浓硫酸、40%(m/m)氢氧化钠溶液、20 g/L的硼酸溶液、0.01mol/L的盐酸标准溶液、无水乙醇、中性甲基红、亚甲蓝溶液、硫酸钾、五水硫酸铜、30%过氧化氢、蒸馏水等。2.1.
36、2实验操作及步骤1、试剂的配制1) 40%的氢氧化钠溶液：40 g氢氧化钠加蒸馏水定容至100 mL。2) 0.01 mol/L盐酸或硫酸标准溶液：可先配制成0.1 mol/L的母液，用时吸取10 mL定容至100 mL。3) 2%的硼酸溶液：2g硼酸加蒸馏水定容至100 mL。4) 混合催化剂：五水硫酸铜和硫酸钾分别研碎,按1:15的比例混合均匀。5) 混合指示剂：0.1%的甲基红乙醇溶液（0.10 g甲基红试剂溶于20 mL无水乙醇乙醇，稀释至100 mL）20 mL与0.1%亚甲基蓝乙醇溶液（2 g亚甲基蓝定溶于100 ml无水乙醇中）10 mL混合摇匀。 2、分析步骤取6个凯氏烧瓶，编
37、号1、2、3、4、5、6，其中1、2、3号为待测样品，4、5、6号为空白对照，分别按下述方法进行操作。1) 试样消化。精密称取牛奶样品（空白样为加蒸馏水）5 ml,小心放入干燥的凯氏烧瓶中, 避免试样附着在管壁；加入混合催化剂10 g, 与试样混合均匀； 再加入25 mL硫酸和5 mL的双氧水；然后将烧瓶以45角斜放在支架上，用第2章 实验材料及方法 电炉缓慢加热，当瓶内泡沫消失后强热至沸。待瓶壁不附有炭化物时，且瓶内液体为澄清浅绿色后，继续加热30 min使其完全分解。消煮好后关闭热源让其自然降温。2) 碱化蒸馏。将消化好并冷却至室温的样品溶液全部转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻
38、度摇匀。向100 mL接受瓶中加入20 mL 2%硼酸溶液和23滴混合指示液，将接收瓶置于冷凝管下口，使下口浸入到硼酸接收液中。再吸取10 mL定容后的样品液，沿小玻璃杯移入反应室，并用少量的蒸馏水冲洗小玻璃杯，塞紧棒状杯塞。向小玻璃杯中加入2030 mL40%的氢氧化钠溶液（过量），慢慢提起棒状杯塞，使氢氧化钠缓慢流入反应室（防止反应室气体从杯塞处外泄），立即塞紧棒状杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸馏水使之密封。通入蒸汽5 min，降低接收瓶位置使冷凝管末端离开液面后再继续蒸馏1 min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。3) 滴定。用0.01 mol/L的盐酸标准溶液滴定接
39、收瓶瓶中的液体，使之刚刚出现灰紫色即为终点，记录所消耗0.01 mol/L的盐酸标准溶液的体积（mL）。4) 计算。根据所消耗的标准盐酸的体积，计算出总的氮的含量，再乘以蛋白质中氮的转化系数即可得到样品中的蛋白质的含量。即：计算公式： 式中：X-试样的蛋白质含量(g/ 100mL) V1-滴定样品消耗盐酸体积( mL) V2-滴定空白样消耗盐酸体积( mL) c-所用标准盐酸的浓度( mol/ L) 0. 014-每毫克当量氮的克数 F-食品中氮换算为蛋白质的系数，奶制品F值为6.38 m-奶样品的质量(g) 2.2 双缩脲法测定牛奶中的蛋白质含量 2.2.1实验仪器及药品双缩脲法中用到的实验
40、仪器及药品除凯氏定氮法外，还需要特别用到的如下所示：实验仪器：722型光栅分光光度计(如图2-1)、试管若干、移液枪、移液管、离心机。图2-1 722型光栅分光光度计实验药品：酒石酸钾钠、碘化钾、酪蛋白（用作标准蛋白）、乙腈、6%NaOH溶液。2.2.2实验操作及步骤1、试剂的准备双缩脲试剂：称取没有丢失结晶水的硫酸铜（CuSO45H2O）3 g，溶于 500 ml新鲜制备的蒸馏水中，加入酒石酸钾钠9 g，碘化钾5 g，搅拌至完全溶解。另取24 g氢氧化钠溶解于新鲜制备的蒸馏水约100 ml 中，完全溶解后加至前述溶液中，最后以蒸馏水稀释至1 L。置聚乙烯瓶内盖紧保存。6%NaOH溶液：先配成
41、NaOH浓溶液，然后稀释成6%NaOH溶液。酪蛋白标准蛋白溶液(1 mg/mL)：准确称取110 mg的酪蛋白，加水溶解定溶至100 mL即为l mg/mL标准酪蛋白溶液。2、掺杂样品处理1）牛奶中掺入尿素溶液的掺假样品处理根据凯氏定氮法测得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液，使每毫升尿素溶液的氮含量等于凯氏定氮法测得的牛奶的氮含量。取不同体积的牛奶5份，样品1为l mL牛奶(作为掺假牛乳的标准样品)，样品25分别为0.9 mL、0.8 mL、0.7 mL、0.5 mL的牛奶，然后向25号样品中添加不同体积的尿素溶液，使得总体积都为1 mL，配制的样品编号及含量如表2-1所示。表2-1 双缩脲法测定
42、方法中牛奶中添加尿素溶液的配制样品编号牛奶所占比例牛奶/ mL尿素溶液/ mL1100%10290%0.90.1380%0.80.2470%0.70.3550%0.50.52）牛奶中掺入三聚氰胺溶液的掺假样品处理根据凯氏定氮法测得的牛奶中的氮含量配置三聚氰胺溶液，使每毫升三聚氰胺溶液的氮含量等于凯氏定氮法测得的牛奶的氮含量。取不同体积的牛奶4份，以样品1作为对照样，样品69分别为0.9 mL、0.8 mL、0.7 mL、0.5 mL的牛奶，然后向69号样品中添加不同体积的三聚氰胺溶液，使得总体积都为1 mL，配制的样品编号及含量如表2-2所示。表2-2 双缩脲法测定方法中牛奶中添加三聚氰胺溶液
43、的配制样品编号牛奶所占比例牛奶/ mL三聚氰胺溶液/ mL690%0.90.1780%0.80.2870%0.70.3950%0.50.53、样品前处理向19号样品中分别加入13 mL乙腈33和5 mL水，剧烈振荡6 min，充分混匀后静置10 min，在10000 r/min转速下，离心20 min，去上清，沉淀待用。将上述各沉淀样品中加入少量的水和l mL的0.1 mol/L氢氧化钠溶液溶解，加水定溶至50 mL待用。4、实验操作步骤1）标准蛋白曲线的绘制(1)取6支试管，编号，取出一支试管作为空白对照，然后分别向其余的5支试管中准确的加入0mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，
44、0.8 mL，1.0 mL浓度为lmg/mL标准蛋白质溶液，然后用蒸馏水分别将各试管补齐到1.5 mL（如表2-3所示）。再向分别各试管中加入1.5 mL6%的氢氧化钠溶液，最后分别向各试管中加入0.15 mL的双缩脲试剂，每加完一管，立刻混合摇匀。(2)经充分混合后在室温下放置30 min。就可以开始用石英比色皿在分光光度计上测定各样品在550 mn处的光吸收值A550nm，空白对照样品为1号试管，即1.5 mL水，1.5 mL6的氢氧化钠溶液和0.15 mL的双缩脲试剂。(3)以用吸光度值A550nm为纵坐标，标准蛋白质量(mg)为横坐标，绘制标准曲线图，可得到一条标准曲线。2）样品中的蛋
45、白含量测定取9只试管并编号，19号试管中各按2.2.2中2中的顺序对应的取一定量的掺杂不同浓度并处理过的未知样品，按照1）中的测定方法，使未知样品测定值在标准曲线的测定范围内。根据所测定的A550nm值，在(3)中制得的标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，再乘以稀释倍数计算出原样品中的蛋白浓度(mg/m1)。表2-3 双缩脲法实验表试管号试剂123456标准蛋白溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸馏水/mL1.51.31.10.90.70.52.3 考马斯亮蓝法测定牛奶中的蛋白质含量 2.3.1实验仪器及药品考马斯亮蓝法中用到的实验仪器及药品与双缩脲法中所用的仪器及药品基本相同，需要特别用到药品的如下所示：实验药品：考马斯亮蓝-G-250染料、85%的磷酸。2.3.2实验操作及步骤1、试剂的准备考马斯亮蓝G-250溶液：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50 mL乙醇中，加入 100 mL