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1、植物生理与生物技术 芜菁小孢子胚胎发生及其显微结构观察研究 乔丽桃， 高 杰， 吴玉霞 ( 新疆农业大学 林学与园艺学院， 新疆 乌鲁木齐 830052) 摘要：以喀什芜菁为材料， 利用显微镜技术， 研究小孢子胚胎发生过程。试验结果表明， 没有进行热激处理的小孢子主 要是沿配子体途径发育， 即从四分体， 经由单核靠边期、 双核期， 发育成为成熟的花粉粒过程； 3 3 热激处理 1 3d后， 小 孢子改变发育途径， 沿孢子体途径发育。 部分小孢子出现细胞膨大， 发生第一次有丝分裂分裂， 形成 2 细胞， 2个子细胞 之一发生垂直于子细胞壁方向的分裂, 形成 “T ” 型 3 细胞原胚然后沿多细胞
2、原胚、 胚柄球形胚、 鱼雷形胚、 心形胚最终 发育成子叶型胚。但随培养天数增加， 大多数膨大的细胞不能分裂或分裂后停止发育。 关键词：芜菁； 小孢子培养； 胚胎发育 中图分类号：Q942文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.10066500.2014.05.003 Research on Microspore Embryogenesis and Microstructure Observation in Brassica rapa L. QIAO Li-tao, GAO Jie, WU Yu-xia ( College of Horticulture， Xinjiang Ag
3、ricultural University， Urumqi, Xinjiang 830052， China) Abstract:Optical microscopes were used to study feature of the microspore embryogenesis inBrassica rapaL The research took kashgar turnips as materials. The test results showed that without heat shock treatment, the microspore is mainly along th
4、e gameto phyte development way, that is, from tetrad, through Uninucleate at periphery, Binucleate stage to develop into mature pollen grain ; after 33 heat treatment, the way of microspore embryogenesis was changed, along the sporophyte development way. Some cells swelled, following the first mitot
5、ic division took place, then was 2-cell formation, one of the two daughter cells divided in vertical direction forming the “T“ type 3 - cell proembryo, and then along the multicellular proembryo, globular-shaped embryo with a at tached suspensor, torpedo-shaped embryo, hearted-shaped embryo, eventua
6、lly developed into cotyledon-shaped embryo. But with culturing days increased, most of the swollen cells cannot divide or stop developing. Key words： turnip; microspore culture; embryogenesis 游离小孢子培养是产生双单倍体的方法之 一， 对加快十字花科蔬菜植物的杂交育种速度， 提 高育种效率具有重要作用。不同物种小孢子胚胎 发生途径受基因型1、 低温2、 小孢子发育阶段3等 很多内外因素的影响。小孢子正常发
7、育方向是通 过不对称核分裂后发育成花粉，而要让小孢子发 育成胚， 就要阻断原有的配子体发育方向， 使小孢 子进行对称性分裂向孢子体方向发育，即对称分 裂才能诱导小孢子胚发生4。外界胁迫被认为是 诱导小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途 径的关键因子， 并使其发生均等分裂。 目前比较常 用的胁迫方式有热激预处理、 低温预处理、 饥饿预 处理和秋水仙素预处理及高 pH 值等1,3,5-6。其中 以热激处理最为常见。小孢子经适当的热激培养 后， 获得胚性， 随之细胞内发生一些特有的形态学 变化， 如细胞核向中央移动、 液泡破裂和细胞膨大 等。刘公社等7和姜立荣等4对大白菜小孢子培养 中热激与非热激
8、处理后小孢子分裂方式变化以及 细胞内超微结构进行了观察，揭示了小孢子胚胎 发生过程中的形态学和结构变化。李菲等8通过 DAPI 荧光染色观察大白菜游离小孢子胚胎发生 过程，发现大白菜小孢子以均等分裂途径为主要 发育途径， 胚胎发生的启动机制是热激诱导下， 单 倍体小孢子体积膨大， 染色体自然加倍， 从而激发 收稿日期：2014-01-24；修订日期：2014-03-04 基金项目: 新疆维吾尔自治区外国专家右玉局引智项目( 20106500083) 作者简介: 乔丽桃( 1987)， 女， 山西右玉人， 在读硕士生， 主要从事蔬菜种质资源研究。 通讯作者简介: 高杰( 1963)， 男， 天津
9、人， 教授， 博士生导师， 主要从事蔬菜种质资源与遗传育种研究。 2014，20（5）：14-18天津农业科学 Tianjin Agricultural Sciences 第 5 期 小孢子进入孢子体发育途径。笔者对芜菁小孢子 进行分别培养，即未进行热激处理培养和热激培 养，显微观察发现热激确实改变了小孢子的发育 途径， 但具体机理和过程仍需进一步探讨。 1材料和方法 1.1材 料 供试材料为新疆喀什地区广泛种植的芜菁。 1.2方 法 1.2.1芜菁小孢子培养及热激处理2013 年 3 月，将喀什芜菁肉质根定植于直径为 30 cm 的花 盆中， 给予正常的田间管理。4 月 11 日， 部分芜菁
10、 开始抽薹。待植株现蕾， 于始花期， 选取 510 个 花 序 置 于 冰 盒 ， 选 择 长 度 为 1.0 1.99， 2.0 2.49， 2.52.99 mm 的花蕾。每一级别取 1520 个 花蕾， 用 2%NaOCl 冲洗 10 min 后用无菌水冲洗 3 次，然后用注射器活塞的底部旋转压榨花蕾 3 圈 半，加 4 mL 的 NLN-13 的培养基提取小孢子， 然 后用冷冻离心机离心 3 次， 转速为 800 r s-1。 倒掉 上清， 留取沉淀。将沉淀用 1 mL 的 NLN-13 培养 基配制成悬浮液，用血球计数板调整小孢子密度 为 104个 mL-1。然后将装有小孢子悬浮液的培
11、养 皿置于 33 恒温培养箱中，暗培养 13 d 后， 最 后于 25 暗培养， 直至出胚。 1.2.2DAPI荧 光 染 色 及 显 微 观 察与上述同 期， 选取 510 个花序置于冰盒， 摘取花蕾， 将花 蕾分为 1.01.99， 2.02.49， 2.52.99 mm 三级。每 一级别取 1215 个花蕾， 花蕾经消毒、 研磨、 分离 纯化后， 按照小孢子培养的步骤进行计数、 培养， 不同的是， 不进行热激处理。每天提取 1 mL 的培 养液， 离心沉淀后， 染色、 制片， 将制备好的切片 置 4 冰箱内， 过夜， 在显微镜下观察。 2结果与分析 2.1DAPI 染色观察芜菁小孢子不经
12、热激处理发 育为成熟花粉粒的形态及核分裂特点 被子植物中， 花粉常用于指 2细胞或 3细 胞时期的雄配子体， 为了与此区别， 一般把从四分 体释放出来到形成成熟花粉之前的雄配子体称为 小孢子4。在显微镜下观察可见， 芜菁的小孢子母 细胞经过减数分裂形成 4 个单倍体的小孢子即四 分体小孢子(图 1-2)， 当小孢子从四分体释放后， 进一步形成明显的壁， 同时体积迅速增大。 随着体 积的增大， 细胞核从中央移到细胞的一侧， 即单核 靠边期小孢子(图 1-4)。 此后小孢子在正常的配子 体发育途径中经历两次分裂，第 1 次分裂形成 1 个营养核和 1 个生殖核，称为双核期小孢子 (图 1-5)，
13、同时两核间形成弧形的细胞板， 小孢子分裂 为两个高度不均等的细胞。第 2 次分裂即生殖核 发生分裂形成 2 个精子，小孢子发育为具有 1 个 营养核和两 2 个精核的成熟花粉粒(图 1-6)。 芜菁 单核期小孢子发育为成熟花粉粒，其外部形态和 体积也相应的发生明显的改变，这为芜菁游离小 孢子培养选取适宜发育阶段的小孢子提供了可靠 的形态依据。 2.2芜菁花粉小孢子细胞的膨大与分裂 对大多数物种来说，适合诱导雄核发育的花 粉发育时期，是在单核小孢子第 1 次有丝分裂即 将开始、 正在进行或刚刚结束的时候9。本试验选 取 2.02.49 mm 长的花蕾， 分离小孢子进行培养。 该长度的花粉小孢子大
14、多处于单核靠边期， 经 33 热激处理， 易于改变发育方向， 使得花粉小孢子 沿着孢子体途径发育。 热激培养 1 d 后观察， 大多 数细胞出现明显膨大。2 d 后膨大的细胞开始分 裂， 而未明显膨大的细胞一般不发生分裂。 同期观 察的情况下，分裂的细胞数大大少于膨大的细胞 数， 这说明分裂仅发生在少部分膨大的小孢子中， 这也印证余凤群等10关于小孢子培养后细胞的膨 大是其分裂的先兆的观点。芜菁小孢子先是分裂 1 次， 随后部分细胞进行多次分裂， 直至最后形成 子叶型胚 （图 2-9） 。观察发现， 在培养过程中， 大 多数细胞停留在 2细胞 （图 2-2） 、 3细胞阶 段， 即 T细胞 （
15、图 2-3）阶段， 不再继续发育， 出 图1芜菁小孢子配子体发育途径 1.芜菁花蕾分级；2.四分体时期(4010) ; 3.单核中期(40 10) ; 4.单核靠边期(4010) ; 5双核期(4010); 6.成熟花 粉粒(4010)。 乔丽桃等： 芜菁小孢子胚胎发生及其显微结构观察研究 15 天津农业科学第 20 卷 现多种细胞形态并存的现象。本试验最后只得到 一个子叶型胚， 出胚率仅有 1/25(胚/蕾)。由此推 断， 随着培养的进行， 部分膨大和分裂的细胞可能 发育受阻失去了活力。 2.3芜菁小孢子胚胎发育过程 游离的芜菁小孢子悬浮于 NLN-13 培养基 中， 经 33 恒温培养箱热
16、激培养 48 h 后， 观察发 现部分小孢子膨大，直径明显大于未激活的小孢 子 （图 2-1） ， 且个别膨大细胞已经开始第一次分 裂。随后在 24 下静置培养， 具有胚状体发生能 力的小孢子， 分裂形成 2细胞原胚。该原胚的 2 个子细胞大小相近。随后， 2 个子细胞之一先发生 垂直于子细胞壁方向的分裂, 形成 “T” 型 3细胞 原胚， 并继而发生垂直于平行方向的分裂， 形成多 细胞团的胚状体部分。 2细胞原胚中的另一子细 胞分裂较慢， 一般发生平行方向分裂形成胚柄。 在 小孢子培养将近 15 d 后， 胚状体一般发育成近似 于圆球状或椭圆形且携带着胚柄。胚的主体部分 显著大于胚柄部分，
17、且细胞小而排列紧密。 随着胚 状体的进一步生长，胚顶端子叶原基分化而使胚 状体呈心形，此时胚柄大多已脱落并游离到液体 培养基中。 随着子叶和胚轴细胞的继续分裂， 胚体 积不断增大而发育成鱼雷胚。 极少数细胞多次分裂 形成球型胚 （图 2-6， 2-7 ） 、 鱼雷型胚、 心型胚 （图 2-8 ） 和子叶型胚 （图 2-9， 2-10 ） 。 观察发现， 芜菁小 孢子胚胎发育的过程中存在着小孢子发育的不同 步性。这与高海娜等11关于甘蓝小孢子处于单核靠 边期的花粉小孢子在同等培养条件下胚胎群体中 同时存在着各个时期的胚状体观点一致。 3讨 论 （1） 本试验在热激培养 1 d 后，有 2细胞 （
18、图 2-2） 出现， 这 2 个子细胞， 大小接近。推测芜 菁小孢子热激培养后，第一次分裂方式为均等分 裂， 但这并不排除不均等分裂的可能性。 早期研究 指出，芸薹属蔬菜小孢子胚胎发育途径既有对称 分裂的 B 途径， 也有不对称分裂的 A 途径12。 刘公 社等7、 李菲等8研究发现白菜中小孢子游离培养 的胚胎发育以 B 途径为主。张菊平等13在研究辣 椒花药培养时，得到多核花粉来源于单核小孢子 的对称分裂或不对称分裂。 试验结果显示， 多数胚 性花粉是通过不对称的小孢子有丝分裂产生的早 期双核花粉中的营养核的分裂产生的。不结球白 菜小孢子胚胎发生的过程及发育途径研究表明， 不结球白菜花粉母细
19、胞减数分裂释放出的小孢子 发育到单核靠边期及稍后时期染色最深、活力最 强。多数游离小孢子培养经历的发育过程与合子 胚相似，小孢子胚胎发育途径既有核对称分裂产 生胚胎的途径(B 途径)， 也有第 1 次不对称有丝分 裂后营养细胞反复分裂单独发育成胚的方式 （A 途径） 14。 （2） 图 2-4， 2-5 类似胚柄的结构的出现， 意 味着细胞在发育初期出现极性分化。很可能与小 孢子的不均等分裂相关， 有待进一步探讨。 这一现 象说明同样处在单核靠边期的小孢子其生理状况 却差异极大， 这对发育的调控提出了更高的要求。 李春玲等15对灯笼椒、 牛角椒、 羊角椒、 线形椒和 朝天椒等辣 (甜) 椒游离
20、小孢子的培养与观察表 明：小孢子最初的细胞分裂有均等和不均等两种 方式， 胚胎发生过程与合子胚发育过程极相似， 直 到心形胚以前均可观察到胚柄的存在。 （3） 游离小孢子在 NLN-13 液体培养基中发 育的启动时间极不一致，热激培养 3 d 后可观察 到多种胚性小孢子共存，与此同时仍观察到不少 图233 热激处理后芜菁胚胎发生过程 1：未激活的小孢子(4010)；2：热激后膨大细胞和2-细胞 (4010)；3：T-细 胞(4010)；45：带 柄 球 形 胚(4010)；6 7：鱼雷形胚(4010)；8：心 形胚(4010)；910：子 叶 型 胚 ； 1112：胚再生。 16 第 5 期
21、单核小孢子， 它们可能继续发育或已经失去活性。 余凤群等10在油菜型甘蓝小孢子的离体培养中发 现， 在培养 45 d 后部分细胞已进行多次分裂， 但 仍有一些细胞停留在 2细胞、 3细胞阶段， 出 现 2细胞、 3细胞与多细胞团并存的现象。然 而从培养细胞的活力测定结果来看，培养 45 d 后小孢子的存活力显著低于细胞膨大和分裂的细 胞频率，说明部分膨大或分裂的小孢子可能发育 受阻而失去了活力。 （4） 获得小孢子胚状体是芜菁小孢子培养应 用于育种实践的先决条件。 从本试验来看， 只有极 少数小孢子最终能发育成胚状体。材料基因型是 胚状体产生的先决条件， 其次就是胚胎诱导。 诱导 的方式有离心
22、、 低温、 高温、 射线、 甘露醇等方法， 目的是从生理生化上改变细胞生理状态、改变其 分裂方式和发育途径16-19。试验中常采用高温进 行诱导， 效果相对较好。 该方法被广泛用于芸薹属 植物的花药培养和游离小孢子培养。栗根义等20 研究表明，高温预处理在白菜游离小孢子培养中 也收到了良好的效果。试验证明，接种后 3335 ， 暗培养 24 h， 对胚状体诱导的效果最为理想。 周伟军等21对油菜游离小孢子分别进行 32 和 30 热击暗培养 3 d 和 7 d 后转入常温 (24 )下 培养， 其胚胎发生好， 产胚率高， 获得了大量正常 胚体。结球甘蓝游离小孢子经过 34 处理 48 h 后，
23、许多小孢子开始膨大，第 3 天就可看到第一 次分裂， 培养 2530 d 后可发育成不同时期的胚， 25 恒温培养的小孢子没有发生分裂现象， 说明 高温热激预处理是促进细胞对称分裂，改变小孢 子发育方向的主要条件22。为了提高小孢子胚产 量， 减少小孢子在通向胚状体形成途径的死亡， 应 该改善分离小孢子的条件，或是通过改善培养条 件和培养方法，以减少分离过程造成小孢子的死 亡， 提高小孢子有效膨大和分裂的比例。 4结 论 本试验在显微镜下观察芜菁游离小孢子热激 培养与小孢子正常发育为成熟花粉粒的过程， 比 较两者在小孢子形态与核分裂方式的差别。结果 显示，单核靠边期小孢子在不同发育途径下其外
24、部形态和细胞核分裂方式都发生了明显改变： 沿 配子体途径正常发育的小孢子从单核期到双核前 期， 圆球形小孢子体积有所增大， 但双核后期小孢 子即由圆球形变为椭圆形。正常发育下单核小孢 子发生不均等分裂， 形成一个大的营养细胞， 营养 细胞内包含一个小的生殖细胞；而诱导向孢子体 途径发育的小孢子，经热激启动后小孢子仍保持 圆球形， 但体积明显膨大， 光学显微镜下观察， 启 动膨大的小孢子细胞先经过一次分裂，形成大小 相近的 2细胞， 此后体积发生一系列分裂， 最终 形成胚状体。由此可以初步判断热激启动的小孢 子孢子体发育途径，单核小孢子变为二倍体的单 细胞。 参考文献： 1 Touraev A,
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