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1、第十章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述,1. 蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。,食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。 蛋白质是生命的物质基础，人体11%13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含
2、量及类型不同。 蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。,蛋白质的测定方法分两大类： 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。,具体测定方法： 凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外： 红外分析仪,氨基酸总量酸碱滴定法测定。 各种氨基酸的分离与定量色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。,第二节 蛋白质的定性测定,一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色
3、反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）,第三节 蛋白质的定量测定,一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉 9.5%， 兔肉 21%， 鸡肉 20%， 牛乳 3.5%， 带鱼 18.0%， 大豆 40%， 面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%， 苹果 1.4% 测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。,一些蛋白质的含氮量 一般为 15% 17.6%，有的上下浮动 可以测出总氮 N,一、 凯氏定
4、氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。,= N6.25 = 蛋白质含量,（一）常量凯氏定氮法,1. 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。,整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定,1. 消化 总反应式：,加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点
5、， 纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高 至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。, 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。, 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。,仪器：219页 要防止爆沸。 另外：介绍“自动回流消化仪”,2. 蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。,3. 吸收与滴定 用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸） 用
6、过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。,吸收,滴定,操作方法：158页，其中讲“以奈氏试 剂”检查氨是否全部蒸完，,以奈氏试剂Nessler试剂，K2（HgI4） 检验NH4+离子，遇铵根，离子析 出黄色或红棕色沉淀。 配制 方法1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。,方法2、 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。,结果计
7、算：158页 注意：F氮换算为蛋白质的系数，一般为 6.25 也可查表。 说明： 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。, 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。, 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 m1 后再继续加热消化。, 若
8、取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。, 般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸馏装置不能漏气。, 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。 氢氧化铜在7090时发黑。, 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。,二、 微量凯氏定氮法,1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50
9、ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置见 159 页图 10-2 。,10-2,10-2,三、 自动凯氏定氮法,1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。,二、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、
10、水杨酸比色法等。,1. 原理 脲（尿素）NH2CONH2 加热至150160时，两分子缩和成双缩脲。,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 CONH 与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）,NH2CONHCONH2 + NH3,注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化,2. 方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样
11、品测定。 3.主要仪器： 分光光度计，离心机（4000 r/min） 4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳,5操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。 三紫外吸收法 1原理：利用蛋白质的特有基团，,对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。,2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3主要仪器： 紫外分光光度计 离心机（3000 5000 r/min） 4操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线,第五节 氨基酸的定性测定,利用各种显色反应（170174页）。,第六节 氨基酸定量测定 一氨基酸的一般定
12、量测定 （一）甲醛滴定法,1.原理：氨基酸本身有碱性 NH2 基，又有 酸性 COOH 基，成中性内盐，加入甲醛 溶液后，与 NH2 结合，碱性消失，再用强碱来滴定 COOH 基。 2特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）,3双指示剂： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液， 0.1%中性红50%乙醇溶液， 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 4操作：同时取两份样： + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和 样液中其它酸性物质。 + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH
13、 滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总 和。 二者之差可计算氨基酸含量,（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。 二个别氨基酸的定量测定 介绍了8种氨基酸的定量测定方法。,第七节 氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来
14、分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。,（一）原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。,Rf = a / b,a,b,样点,溶剂前沿,点样原点,优点： 展开时间短，一般在2030分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。 层析后得到的斑点小而清晰。 能够使用多种显色剂。 点样量少，灵敏度高。（比纸层析
15、高10100倍） 精确到0.01ug。 也可用于大量分离500 mg，作为样品制备层析。 缺点：Rf值重现性比纸上层析差。 分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。,（三）操作方法： 薄层板制备 样品液制备 点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为 原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔12cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。, 展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度1030，下端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过了样
16、点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。,a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的23种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。,b.展开剂的选择方法： .微量圆环法。 .用小载波片试验，微量展开剂展开5cm。 .图解法： 样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。 样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。 有机溶剂极性由小到大为： 石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。,c.展开的方式： 上行法、下行法、双向展开、单向
17、多次展开、双向多次展开。 双向展开：, 显色： a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。 b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。 c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。 （涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中）,定性：在同一块板上，同等条件下操作，被测样与标准样同时展开、显色，同 Rf 值即是； 查手册找相同的 Rf 值。 定量：a.目视定量法：以标准斑点对照，相当于样品斑点中含量ug数。 b.斑点面积定量法。 c.将样点取下来，定容，离心，比色。 d.利用薄层色谱扫描仪： 例：日本岛津 CS910 型双波长薄 层色谱扫描仪,介绍离心薄层色谱仪：,1. LBG 1型离心薄层色谱仪 北京产 2. 7924型离心薄层色谱仪 美国Harrison 公司研制 3. CLC 5型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达 10g 。 二氨基酸自动分析仪法 三气相色谱法 四高效液相色谱法,10-3,第十章的重点,凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 双缩脲法测定原理。 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 TLC法原理、方法，Rf值的作用及计算方法。,