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1、背景知识六：菌种保藏技术,武汉职业技术学院,微生物技术应用,微生物会发生变化吗？ 分离得到的微生物可以直接用于生产吗？ 怎样保存微生物？,知识节点一 遗传变异的物质基础 知识节点二 原核微生物的基因重组 知识节点三 真核微生物的基因重组 知识节点四 微生物育种技术 知识节点五 菌种保藏技术,知识节点一 遗传变异的物质基础,遗传： 变异： 遗传型/基因型： 表型：指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。 饰变：指微生物的某些改变是指不涉及遗传物质结构改变，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,一、三个经典实验证实核酸是遗传变异的物质基础 （一）经典转化
2、实验：,2、细菌培养试验 热死S菌 不生长 肺炎双球菌 活R菌 长出R菌 热死S菌+活R菌 长出大量R菌+10-6S菌,（二）噬菌体感染实验,（三）植物病毒的重建实验 TMV重建实验示意图(箭头表示遗传信息的去向),二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式 (一)细胞水平 1 核染色体 2 质粒 （1）致育因子（F因子）又称致育因子或性因子 （2）抗性因子（R因子） 又称R质粒 （3）产细菌素因子 （ 4）诱癌质粒（Ti质粒） （5）巨大质粒（mega质粒） （6）降解性质粒 (二)分子水平 核酸（DNA、RNA）,知识节点二 原核微生物的基因重组,基因重组：将两个不同性状个体细胞内的遗传基因移到
3、一个个体细胞内，经过遗传分子间的重新组合，形成新的遗传性个体的过程。 获取外源DNA的方式 原核微生物 转化 裸露的DNA 基因重组的方式 转导 噬菌体作媒介 接合 细菌之间的接触 相同：基因转移导致遗传重组,一、转化 （一）定义 转化或转化作用： 转化因子：具有转化活性的外来DNA片段 转化子：转化后出现了供体性状的受体细胞 （二）转化微生物的种类 肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属）、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属和黄单胞菌属,（三）转化的条件 能进行转化的受体细胞必须处于感受态，同时有外源DNA片段存在，才能实现其转化。 （四）转化过程 （五）与转染区别）,抗链霉素基因s
4、trr,链霉素敏感型基因strs,二、转导 完全缺陷噬菌体： 转导噬菌体/转导颗粒 部分缺陷噬菌体： 转导子：获得新遗传性状的受体细胞,（一）普遍转导 1 完全普遍转导,2 流产转导,（二）局限转导 1. 低频转导 （LFT） 部分缺陷噬菌体的形成 当部分缺陷噬菌体感染宿主细胞并整合在宿主的核基因组上时，可使宿主细胞成为一个局限转导子（而不是一个溶源菌， 对噬菌体不具有免疫性）。,2. 高频转导 （HFT） 当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常噬菌体的基因可补偿dgal所缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。 因此由双重溶源菌所产生的裂解物中，含有等量的和dgal粒子，这
5、就称HFT（高频转导）裂解物,（三）普遍性转导和局限性转导的比较,三、接合 （一）定义 接合：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。 接合子：通过接合而获得新性状的受体细胞。,（二）Ecoli的四种接合型菌株,（三）几种杂交的结果： 1.F+ 与F-的杂交 杂交的结果：供体菌和受体菌均成为F+细胞 没有供体菌染色体DNA的转移 2. Hfr 与F- 的杂交 杂交后的受体细胞仍然是F- 部分供体菌DNA染色体转移到受体菌中 3. F与F-杂交 受体细
6、胞也就变成了F 部分宿主细胞的DNA随F因子进入受体菌细胞,（四）原生质体融合 是将遗传性状不同的两种菌融合为一个新细胞的过程 主要包括原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子的选择等步骤。,知识节点三 真核微生物的基因重组,一、有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术 二、准性生殖 是一种类似于有性生殖，但比有性生殖更为原始的一种生殖方式，它可使同种物两个不同菌株的体细胞发生融合，并不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程,准性生殖和有性生殖的比较,知识节点四 微生物育种,微生物菌种选育途径：自然选育、定向选育、诱变育种、杂交育种 一
7、、利用自发突变进行的育种 （一）自发突变原因 1.环境因素对微生物的诱变作用 各种短波辐射和高温等 2.DNA复制 3.微生物自身产诱变物质,（二）自发突变与育种 1.自然选育 在日常生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程 2.定向育种 是指在某一特定条件下，用某一特定因素长期处理某微生物的群体，同时不断地对它们进行移种传代，以积累自发突变，并最终获得优良菌株的过程,二、诱变育种 指用人工的方法处理均匀而分散的微生物细胞群，促使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用 （一）诱发突变原因诱变剂 1.物理因素的诱变 （1）紫外线 （2）x
8、射线和r射线 （3）热和激光等,2.化学因素的诱变 （1）碱基结构类似物 5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP） （2）与核酸上碱基起化学反应的诱变剂 结果使A H（次黄嘌呤） G X（黄嘌呤） C U（尿嘧啶） （3）移码突变,（二）诱变育种 诱变育种的基本过程如图： 1.诱变育种的基本过程操作方法,2.产量突变株的筛选,3.抗药性突变株的筛选 抗药性基因：选择性遗传标记、重要的生产菌种。 筛选方法： （ a）梯度平板法 ：梯度平板法定向筛选抗异烟肼的吡多醇高产酵母菌突变株,（b）影印平板培养法,4.营
9、养缺陷型突变株的筛选 （1）营养缺陷型 （2）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基 基本培养基MM-： 完全培养基CM+： 补充培养基SMA/B： （3）与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个体,（4）营养缺陷型的筛选方法,夹层培养法及其结果,影印接种法及其结果,知识节点五 菌种保藏技术,一、菌种衰退和菌种的复壮 1、什么是菌种的衰退？ 2、菌种衰退有怎样的表现？ 3、菌种退化的原因是什么？ 4、如何防止菌种衰退？ 5、如何复壮菌种？ 二、菌种保藏 1、菌种保藏的目的是什么？ 2、菌种保藏的原理是什么？ 3、常用的菌种保藏方法有哪些？各如何操作？,一、菌种衰退和菌种的复壮 1、菌种衰退：指生产菌
10、株性状的劣化或遗传标记丢失的现象。,纯菌种,自发突变,突变个体,传代增殖,原始个体,不纯菌种,衰退菌种,2、菌种衰退表现 菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力下降等,3、菌种衰退的原因 基因变异主要原因 菌种衰退的基本原因是有关基因发生负突变， 连续传代加速衰退 不适宜的培养和保藏条件加速衰退,4、菌种衰退的防止 控制传代次数 创造良好的培养条件 利用不易衰退的细胞移种传代 采用有效的菌种保藏方法 讲究菌种选育技术 定期进行分离纯化,5、菌种的复壮 狭义的复壮消极的措施 是指在菌种已经发生衰退的
11、情况下，通过纯种分离和典型性状、生产性能等指标测定，从中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。 广义的复壮积极的措施 是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。,菌种复壮的主要方法 纯种分离法：分离仍保持原有典型性状的单细胞 淘汰法：处理（如药物、低温、高温等）衰退菌种，淘汰已衰退个体 遗传育种法：退化的菌种重新进行遗传育种 宿主体内复壮法：对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应宿主体内来提高菌株的毒性,二、菌种保藏 菌种保藏是一种保持微生物菌株的生活力和原有性状的方法。 1、菌种保藏的
12、目的 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不被污染、不变异 变异不可避免,但可减缓变异速度。,2、菌种保藏的原理 人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于休眠状态 挑选典型菌种的优良纯种进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等,3、常用的菌种保藏方法,菌种保藏技术,（1）斜面低温保藏法 （2）蒸馏水保藏法 （3）真空冷冻干燥保藏法/冷冻干燥保藏法 （4）液氮冷冻保藏法,（1）斜面低温保藏法常用保藏法 菌种在适宜的斜面上 4冰箱中 生长完全 保藏 每隔一定时间（保藏期 1-6个月）后 新的斜面上 4 生长 保藏 此法广泛适用于各
13、大类微生物菌种的短期保藏,此法的主要保藏措施是低温。原理是低温抑制生长。 优点是简便易行，容易推广，存活率高； 缺点是保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。 螺旋口试管替代传统的棉塞、减少培养基碳水化合物的含量,（2）蒸馏水保藏法： 菌种制备 蒸馏水灭菌 接入菌种 不要沾湿棉塞 塞紧 室温保藏 螺旋口试管或加橡皮塞试管 10 或18 可保藏1年左右 适用于丝状真菌、酵母型真菌及细菌中的肠道菌科。 思考： 原理、优缺点、改进,其原理是对菌丝体造成营养饥饿，从而抑制菌丝的生长。 简便，使用方便，取后剩余可继续保藏 也可用不含养分的溶液如0.25M磷酸缓冲液（Ph6.5）或生理盐水,（3
14、）真空冷冻干燥保藏法/冷冻干燥保藏法，简称冻干法： 一般菌种可保存5年-15年。 除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状真菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%（霉菌、蕈菌、藻类）。,安瓿管 菌种菌种要纯 配制保护剂如脱脂牛奶、海 藻糖、血清白蛋白、糊精 酸洗、水洗 培养生长良好 分装 烘干 制备菌悬液浓度应高 灭菌 灭菌 分装安瓿管 预冻低温冰箱20-60m或冷冻剂5-10m至-30 真空干燥在30m内达到93.3Pa（0.7mmHg） 装在歧管上抽真空慢干至26.7Pa0.2mmHg 火焰上熔封安瓿管口 检测真空 保藏冰箱或室温暗处,冷冻干燥保藏管
15、 一种简易冷冻干燥装置 思考： 原理、优缺点,是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的方法 冷冻干燥保存的菌种存活时间长、变异率低、效果好，便于大量保藏，还具有体积小、不易污染、便于运输等优点 缺点是设备和操作都比较复杂。,（4）液氮冷冻保藏法： 原则是“慢冻快融” 许多细菌可保藏15年以上。 此法除适宜于一般微生物的保藏外，一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都适用,准备安瓿管 加保护剂与灭菌 能耐受温度突然变化 霉菌菌丝体：安瓿管内预先加入保护剂 接菌种入安瓿管细菌10的甘油蒸馏水菌悬液 霉菌菌丝体用灭菌打孔器切取菌落圆块 用火焰熔
16、封，浸入水中检查 冻结以每分钟下降1的慢速冻结至-30 保藏立即放入液氮冷冻保藏器内（气相为 -150，液态氮内为-196）,恢复培养：需用时，将安瓿管取出，立即放入3840的水浴中震荡，1分钟内全部融化。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养 防爆炸、防冻伤，要戴皮手套操作。,低于-130微生物代谢停止，处于休眠状态 优点：保藏期长、变异率低、效果好、方法简单、保藏的对象也最为广泛 缺点：需要特殊设备、 液氮消耗较多费用较高,4、菌种保藏机构 美国标准菌种收藏所 ATCC采用冷冻干燥保藏法和液氮保藏法来保藏所有菌种。 中国微生物菌种保藏委员会CCCCM采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏。,ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图 至少在20年内， 获得该菌种的用户， 至多只是原种的第二代,