流式细胞技术及其应用.ppt

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1、流式细胞技术及其在科研中的应用,哈尔滨医科大学附属二院检验科 刘彦虹,课程内容,第一部分 概要 第二部分 仪器构造及工作原理 第三部分 技术及方法 第四部分 应用,第一部分 概要,1.1 基本概念,流式细胞技术（Flow Cytometry, FCM） 是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。(荧光显微镜技术的改良) 流式细胞仪（Flow Cytometor, FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。 又称 (Fluorecence activated cell sorter

2、, FACS) FACSort FACSCalibur FACSVantage,1.2 技术特点,单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制成单细胞悬液。 快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。,1.2 技术特点,多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数等更为准确。 定性或定量分析：通过荧光

3、染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。,第二部分 仪器构造及工作原理,2.1 仪器构造,1. 流动室及液流驱动系统 2. 激光光源及光束形成系统 3. 光学系统 4. 信号检测与存贮、显示、分析系统 5. 细胞分选系统,2.2 工作原理,1. 流动室 仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430180um长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心。 流动室内充满鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准

4、确的细胞荧光信息。,液流驱动系统 将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流速（即鞘流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。,2.2 工作原理,2.2 工作原理,2. 激光光源 目前FCM大多采用氩离子气体激光器，波长为488nm。激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。用聚焦透镜对激光光束聚焦后，可以在照射区得到一个近似扁平

5、的椭圆形光斑，其厚度可达20m。当流动的细胞经过光斑时才能被激光照射并产生光散射和发射荧光。,2.2 工作原理,3. 光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。,2.2 工作原理,4. 信号检测 （1）散射光信号 前向角散射(Forward Scatter, FSC ) 侧向角散射(Side Scatter, SSC) （2）荧光信号,前向角散射光（FSC）,激光器,激光器,激光探测器,大颗粒,小颗粒,侧向角散射光（SSC）,激光器,侧向散射光探测器,2.2 工作原理,5. 数据的存贮、显示与分析 FCM数据存贮的方式均采用

6、列表排队方式。 数据的显示通常有一维直方图、二维点图等。,2.2 工作原理,单参数直方图,二维散点图,2.3 细胞分选原理,当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方的压电晶体产生机械振动带动流动室以相同频率进行振动，使液流注断裂成一连串均匀的液滴，仅少量液滴含有细胞，有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了被分选的细胞的特性参数时， 此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左的偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目的。,第三部分 技术要点,3.1 荧光探针

7、的选择,1. 根据仪器类型选择荧光探针 FACSort 配有488nm单激光器。 FACSCalibur 配有488nm和633nm双激光器。 2. 根据荧光强度大小选择荧光探针 各种荧光色素有不同的发射荧光强度。在多色免疫荧光分析中，应选择荧光强度最强的荧光色素标记的单克隆抗体，尤其是对于表达量较低抗原的分析更是如此。,常用荧光染料的特性,荧光染料 分子量 激发波长(nm) 发射波长(nm) 颜色 用途 FITC 390 488 525 深蓝 免疫荧光 PE 240000 488 575 橙色 免疫荧光 PerCP 35000 488 677 红色 免疫荧光 PeCy5 224000 488

8、 670 红色 免疫荧光 PeCy7 224000 488 755 深红色 免疫荧光 PI 488 620 橙红色 免疫荧光 APC 104000 633 670 红色 免疫荧光,异硫氰酸荧光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC） FITC是一种最为常见的荧光探针，其分子量为389Da，用488nm的激光激发后发射荧光的峰值在520nm附近，使用53015 nm的带通滤光片可得到最佳的荧光检测信号。FL1探测器检测FITC。,3.1 荧光探针的选择,藻红蛋白 ( p-phycoerythrin,PE) PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子

9、量为240kD的蛋白，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用58521nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用57513nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。,3.1 荧光探针的选择,多甲藻叶绿素蛋白 （peridinin chlorophyll protein，PerCP） PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。,3.1 荧光探针的选择,3.1 荧光探针的选择,碘化丙啶 （ propidiu

10、m iodide，PI） 可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。 在FL2探测器检测。 FL2探测器检测PI。,3.2 免疫荧光染色,直接免疫荧光染色法 多用于对细胞表面标志的染色分析。选用单克隆荧光抗体是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗体，一个抗体针对一个抗原。特异性强，荧光标记干扰因素少，但需购买多种荧光标记单抗。 间接免疫荧光染色法 选用特异性单抗（一抗）与待测细胞结合后，再用荧光素标记的二抗（针对一抗的抗原特异性的）进

11、行标记染色。适用于对一些新的未知抗原的检测，不需要多种荧光抗体。,3.4 光谱重叠的补偿,由于细胞或微球携带两种或两种以上荧光素，受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时， 理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测， 而不会检测到另一种荧光。 由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同， 使用了BP（带通）和LP（长通）滤片后， 发射光谱范围仍有一定的重叠。克服这种误差最有效的方法是使用荧光补偿，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。,3.4 光谱重叠的补偿,设置补偿的基本步骤 （1）选择标准荧光微球或正常细胞。 （2）调节光电倍增管（PM

12、T）电压，使未染色 细胞或微球的荧光峰处于10道以内。 （3）画出被分析细胞或微球的门或区域。 （4）增加补偿设置，直至阳性和阴性细胞或 微球处于最合适的位置。,3.4 光谱重叠的补偿,3.4 光谱重叠的补偿,3.4 光谱重叠的补偿,设门（gating）是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。 “设门” 是指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。 通过“设门”得到不同的 区域（Region）。从而对其中的细胞进行单参数或多参数分析。,3.5 设门策略,3.5 设门策略,（1）在线设门 又称为实时设门，是指在流式细胞仪获 取数据

13、时就限定散射光和（或）荧光信号的范围。在线设门对所需要实时完成的实验，如淋巴细胞亚群和造血干/祖细胞的绝对计数、HLA-B27、细胞分选等具有重要意义。,3.5 设门策略,对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型,3.5 设门策略,（2）离线设门 又称为非实时设门（non-real time gating）， 是指在流式细胞仪已获取数据后，通过计算机软件将数据调出，设定不同的散射光和（或）荧光信号范围进行数据分析的设门方式。适合于一些需要多重设门并进行较为复杂分析的数据，尤其是对于一些荧光染色强度不定的样本，可以采用较大范围的散射光阈值设门，获取所有信号并储存在计算机硬盘等介质中，再进行离线

14、设门分析，可以更好地保持数据的完整性。,3.5 设门策略,白细胞和血小板的光散射设门,3.5 设门策略,FL2-W/FL2-A设门排除双连体细胞对G2/M期细胞比例的影响,3.5 设门策略,检测范围,细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体,第四部分 应 用,4.1 免疫表型分析,用荧光素标记的单克隆抗体作为分子探针，检测细胞上的特异性抗原分子，称为免疫表型分析。可同时鉴别单个细胞上的多种抗原。 国际人类白细胞抗原协作组（HLDA）将细胞

15、表面抗原统一编号，用分化群（cluster of differentiation, CD）命名，目前已达247种。 CD分子是细胞(白细胞、红细胞、血小板及血管内皮细胞等)在分化成为不同谱系、不同阶段细胞以及活化过程中或疾病状态下出现或消失的细胞表面标记。,4.1.1 样品制备,血液或骨髓 采集使用EDTA-K2或EDTA-K3抗凝，抗凝剂终浓度为1.52mg/ml。标本采集后室温保存，6h内处理。 由于标本已经属于单细胞悬液，不需特殊处理。但一般分析白细胞时需要用红细胞裂解液去除红细胞，或用特殊方法分离淋巴细胞或其他白细胞。,4.1.1 样品制备,体液和各种灌洗液 新鲜采集的标本，10001

16、500r/min离心5min，弃去上清取细胞沉淀，用含0.1牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤12次，经50m的尼龙网过滤后悬浮在0.51ml PBS中待用，一般细胞浓度为（25）106/ml，当细胞数不足时可增加标本量进行浓缩。,4.1.1 样品制备,各种组织细胞 由于是进行免疫表型分析，应使细胞表面抗原在处理过程中保持其抗原活性，并且不发生丢失。因此，不宜选用甲醛、乙醇等固定组织，不宜用酶、表面活性剂等处理细胞。 手工剪切法 单细胞仪制备法 匀浆50um尼龙网过滤后，用含0.1%BSA的PBS 10002000r/min 离心5min，洗涤2次，悬浮备用。,4.1.2 抗体选择,根据

17、信噪比选择抗体的滴度：特异性荧光信号与非特异性结合噪音（同型对照）的比值越大，表明阳性与对照荧光峰分离越好，可确定为最佳抗体滴度。 抗体组合的选择：多种荧光素标记的单克隆抗体组合应用之前，必须将每种抗体单独应用和组合应用的结果进行比较，无差别结果时才可组合使用。 组合应用时，注意抗体的稀释度。单独使用最佳用量为20ul，而如3种组合时，总体积增至60ul，每种抗体被稀释，不再是最佳用量。,4.1.3 免疫荧光染色,直接免疫荧光染色法： 单色免疫荧光染色法 多色免疫荧光染色法 间接免疫荧光染色法： 单色免疫荧光染色法,4.1.4 荧光染色对照的设置,阳性对照 是指用已知表达某种抗原的细胞作为样本

18、检测，应出现阳性结果的对照实验。是检查已知阳性标本能否用所测条件与方法确定为阳性，否则可能是单克隆抗体的质量与浓度、荧光染色条件、仪器状况等存在问题。阳性对照达不到要求时不能进行实验。,阴性对照 是指用已知不表达某种抗原的细胞作为样本检测，应出现阴性结果的对照实验。阴性对照试验可以避免单克隆抗体的纯度不够或特异性差等因素造成的假阳性结果。,4.1.4 荧光染色对照的设置,4.1.4 荧光染色对照的设置,同型对照 是指与单克隆抗体相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光素，如：IgG1 FITC、IgG2a PE等。同型对照主要考虑了细胞的自发荧光、Fc

19、受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与单克隆抗体所标记的荧光色素、浓度、标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值（F/P比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与单克隆抗体不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备的产品。,4.1.4 荧光染色对照的设置,4.1.6 标本的固定与保存,固定用于延长检测时间。 荧光抗体与细胞抗原结合后，一些低亲和力的抗体在洗涤过程中可能与抗原分离，或不能及时检测，可导致假阴性或阳性减弱。 终浓度为1%多聚甲醛，固定30分钟。 在荧光染色之后进行。24小时之内检测。最长可达10天。,4.1.

20、7 免疫表型分析的影响因素,抗体的用量：使用抗体浓度3g/ml时，表明抗体的亲和力或特异性低，最好不用。 最佳浓度一般为0.011 g/ml，相当于每个测试10100ng。 非特异性结合（NSB）：是指非抗原抗体的结合。Fc受体结合抗体是导致其重要因素。任何细胞上只要存在未结合的Fc受体，都可能有NSB。采用高浓度的纯化鼠IgG可用于阻断Fc受体的NSB。免疫球蛋白聚集可增加NSB。由于冰冻、复溶和冻干处理，抗体均可出现聚集。对于新近购买的抗体，可通过高速离心去除聚集。 抗原抗体反应温度：一般在室温条件下进行。 死细胞：可增加抗体的非特异结合。因此，标本采集后应尽快进行荧光染色，固定后的保存时

21、间可相对较长。此外，也可在标本制备前计数死细胞的百分率。,4.2 细胞周期与DNA倍体分析,在生物细胞核中，DNA含量并非恒定，随细胞增殖周期时相不同而发生变化。 整个细胞周期从DNA含量变化可以描述为G0/G1、S、G2/M期三个细胞峰。 G0/G1期细胞的DNA含量相同，均为二倍体DNA含量。 G2/M期细胞的DNA含量均为四倍体DNA含量。,4.2 细胞周期与DNA倍体分析, 4.2.1 FCM分析的基本方法,荧光染料（如PI）与细胞DNA分子特异结合，而且有一定的量效关系，即DNA含量的多少与荧光染料结合量成正比，荧光强度与荧光直方图的通道数成正比。 在流式细胞分析DNA中，只有在染色

22、体数目变化引起DNA含量与正常细胞有差异时，才可能有DNA异倍体检出。在DNA含量未见异常并不能除外染色体异常的存在。, 4.2.2 DNA含量的表示方法,细胞群的DNA含量在FCM分析中一般以DNA指数（DNA index，DI）表示其相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其 G0/G1期细胞DNA含量为2C，DI值1.0。 DI=样本G0/G1期细胞峰平均荧光道数/正常二倍体标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧光道数,4.2.1 DNA倍体的判定标准,倍体（ploidy）原指染色体数目。 流式细胞分析中用来描述总的 DNA总量。 根据DI判定DNA倍体。 DI=1.00.1（0.901.10）为二

23、倍体 DI=1.00.15（0.851.15）为近二倍体 DI=2.00.1（1.902.10）为四倍体 DI2.10为多倍体 其余DI值均为非整倍体,1. 单细胞悬液制备 新鲜或新鲜冰冻标本： 白血病标本、穿刺液很容易获得单细胞悬液。实体肿瘤可在含去污剂的缓冲液中手工机械处理，细胞核可释放至悬液中。 新鲜固定的标本： 标本切成12mm2的小块，在含胃蛋白酶的0.1mol/L HCl液中孵育或用胰蛋白酶处理，使其释放细胞核。 甲醛固定、石蜡包埋的标本： 从包埋组织上切片至少50m厚，太薄的切片会含有太多切碎的核，从而增加DNA直方图的碎片干扰。组织切片被脱蜡、经过乙醇处理并水化后，用蛋白水解酶

24、处理，使其释放细胞核。,4.2.2 样本制备,2 固定 采用70%预冷乙醇(04C)。 运送标本时应保证样本完全浸没在固定剂中。 由于PI不能通过活细胞进入胞内染色，因此要用乙醇将细胞膜打孔，把染料引入胞内并将细胞固定。 若同时使用抗体鉴别细胞应选择对抗原无损的固定剂，并在抗体标记之后进行固定。,4.2.2 样本制备,4.2.2 样本制备,3染色 应用PI染色液。染料要足够，以保证饱和结合。PI的推荐浓度至少为20ug/106细胞。 由于PI也与双链RNA结合，分析前样本应用RNase处理。 细胞用50um尼龙网过滤后上机检测。,4细胞浓度 单细胞或细胞核的最终浓度应为 106/ml。浓度太低

25、时，流式细胞仪检测室样本的流速不得不提高，从而使CV增大。如果细胞或细胞核浓度太高，则可能导致染料的相对不足，影响CV和检测结果。 流式细胞分析的高分辨率或精密度可检出不同细胞群体DNA含量的细微差别，通常的检测分辨率或精密度由DNA含量直方图中G0/G1峰的变异系数（CV）来反映。CV越小，质量越好。新鲜标本CV常3%，石蜡包埋标本的CV5%。,4.2.2 样本制备,4.2.2 样本制备,5样本制备的质量 制备完成后的标本可用光学显微镜检查其质量，注意观察： 样本中细胞或细胞核浓度 细胞聚集或过多的碎片 大多数核有肿瘤样的外观 分离的核上没有参与细胞质附着,4.2.3 样本分析,4.3 细胞

26、凋亡检测,细胞凋亡(Apoptosis)是指有核细胞在一定条件下，通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。,4.3.1 细胞凋亡的生化特征,Caspase 蛋白酶和丝氨酸蛋白酶激活： 核酸内切酶激活：DNA电泳出现“梯状”改变。 线粒体通透性增高：线粒体膜电位下降。 胞质Ca2+和pH变化：细胞内Ca2+升高， pH降低。,4.3.1 FCM检测凋亡的方法,凋亡细胞形态学特征的检测 细胞对染料吸收能力的检测 Caspase的检测 线粒体功能的检测 细胞内钙离子和pH的检测 溶酶体质子泵变化的检测 DNA断裂的检测 细胞DNA含量的检测 蛋白及RNA含量的检测 膜磷脂重新分布的检测 凋

27、亡小体的检测 凋亡相关蛋白的检测,4.3.1.1 PI单染色法,原理 由于凋亡细胞DNA被降解后，小分子DNA可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分DNA，造成了凋亡细胞的DNA含量非倍体性下降，由此可导致对DNA染料的着色能力下降，表现为在G1期峰前出现亚二倍体峰，即亚G1期峰。常用的DNA染料为PI。由于PI不能通过活细胞进入胞内染色，因此具体操作时要用乙醇将细胞膜打孔，把染料引入胞内并将细胞固定。由于PI同时与细胞内RNA和DNA结合，因此需用RNA酶将RNA降解，方可检测细胞DNA含量的变化。,4.3.1.2 Annexin V/PI双染色法,原理 在凋亡细胞的形态学改变中

28、，胞质膜的改变是最早出现的。在凋亡的早期阶段，细胞内Ca2+快速、持续升高，致使大量Ca2+激活谷氨酰胺转移酶，谷氨酰胺转移酶的活化使胞质膜磷脂不对称性丧失，导致膜内侧PS从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死在早期阶段细胞膜的完整性就被破坏了。由于PI对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此， Annexin V结合PI进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。由于正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin V，坏死和凋亡晚期细胞可被PI染色，因此可将各群细胞明显地区分开。,谢谢,