ADIPONUTRIN MRNA 在分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中的表达.pdf

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1、中国药理学通报 C h i n e s e P h a r m a c o l o g i c a l B u l l e t i n 2 0 0 6 D e c ; 2 2 ( 1 2 ) : 1 5 3 5 - 6 1 5 3 5 令研究简报令 A d i p o n u t r i n m R N A在分化成熟的3 T 3 - L l 脂肪细胞中的表达 刘 莉， 王佑民， 丁振兴， 杨明功 ( 安徽医 科大学内 分泌代谢病研究所 第一附属医院内 分泌科， 安徽合肥 2 3 0 0 2 2 ) E x p r e s s i o n o f a d i p o n u t r i n m

2、R N A i n m a t u r e 3 T 3 - L l a d i p o c y t e s L I U L i ， W A N G Y o u - m i n ， D I N G Z h e n - x i n g , Y A N G M i n g - g o n g ( I n s t i t u t e of E n d o c r i n o l o g y a n d M e t a b o l is m ; A n h u i M e d i c a l U n i - v e r s i t y , th e F i r s t A f fi l i a t e

3、d h o s p it a l o f A n h u i M e d ic a l U n iv e r s i ty , 收稿 日 期 基金项 目 作者简介 ; 2 0 0 6 - 0 8 - 0 2 ， 修回日 期: 2 0 0 6 - 1 0 - 1 0 : 安徽省自 然科学基金资助项目( N o 0 3 0 4 3 7 1 9 ) 莉( 1 9 8 0 一 ) ， 女， 硕士生， 研究方向: 糖尿病与肥胖 , E - m a i l : m o n k e y . 1 t o m . c o m; H ef e i 2 3 0 0 2 2 , C h i n a ) 中 国图书分类

4、号: R - 3 3 2 ; R 3 2 9 . 2 4 ; R 3 4 1 ; R 3 4 2 . 2 2 ; R 3 9 4 . 2 文献标识码: A 文章编号: 1 0 0 1 一 1 9 7 8 ( 2 0 0 6 ) 1 2 一 1 5 3 5 一 0 2 关键词: A d ip o n u t ri n ; 3 T 3 - L l 脂肪细胞; T N F - a ; 毗格列酮 K e y w o r d s : A d ip o n u t ri n ; 3 T 3 - L l a d ip o c y t e s ; T N F - a ; P i o g l i t a - z

5、one 随着研究的深入， 现已发现脂肪组织是全身较为重要的 内分泌器官。脂肪产生的因子包括瘦素、 脂联素、 T N F - a 、 I L - 6 和P e r i l i p i n 等。 已 经 证实 许多 脂肪产生的 蛋白 在能 量平衡 方面有着重要的作用。 A d i p o n u t ri n 是新近发现的一种非分 泌 蛋白 ， 它 主 要 表 达在 脂肪 组 织中， 包括白 色 脂肪 组 织如 刘症 王佑民( 1 9 6 4一) ， 男， 教授， 硕士生导师， T e l : 0 5 5 1 2 9 2 2 0 6 9 , E - m a il : y o u m i n w a

6、 n g 2 1 e n . c o m 1 5 W a h l S M, C h e n W. T r a n s f o r m i n g g ro w t h f a c t o r - b e t a - i n d u c e d re g u - l a t o ry T c e ll s re f e r e e i n fl a m m a t o ry a n d s u t o i m m u n e d i s e a s e s J . A r t h r i t is R e s Ae r , 2 0 0 5 , 7 : 6 2 一 8 . 1 6 M u l l

7、e r - L a d n e r U , G a y R E , G a y S . R o l e o f n u c l e a r f a c t o r k a p p a B i n s y n o v i a l i n fl a m m a t io n 仁 J . C u r r R h e u m a t o l R e p , 2 0 0 2 , 4 : 2 0 1 - 7 . 1 7 O c h i T , O h k u b o Y , M u t o h S . R o l e o f c y c l o o x y g e n a s e - 2 , b u t

8、n o t c y c l o o x y g e n a s e - 1 ， o n t y p e 1 1 c o l l a g e n - i n d u c e d a rt h r i t i s i n D B A / 1 J m i c e J . B i o c h e m P h a r m a c o l , 2 0 0 3 , 6 6 : 1 0 5 5 一 6 0 . 1 8 胡成穆， 李 俊， 金涌， 彭磊. 美洛昔康凝胶治疗A A大鼠 的 疗效与局部药物浓度的关系研究【 J . 中国药理学通报， 2 0 0 4 , 2 0 ( 8 ) : 8 9 0 一 3 1

9、8 1 H u C M , L i J , J i n Y , P e n g L . T h e re l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e r a p e u - t i c e ff e c t s a n d c o n c e n t r a t i o n i n t i s s u e o r s e r u m o f M e l G J . C h in P h a r m a c o l B u l l , 2 0 0 4 ， 2 0 ( 8 ) : 8 9 0 一 3 . 仁 1 9 施 文， 王永铭， 李少丽， 等. 类风湿性关

10、节炎患者服用双氯芬 酸、 蔡丁美酮、 美洛昔康、 塞来昔布6 m o n 生存质量的队列研究 J . 中国药理学通报， 2 0 0 4 , 2 0 ( 6 ) : 6 3 6 - 4 0 . 1 9 S h i W, W a n g Y M, L i S L , e t a l . C o h o rt s t u d y o f q u a l i t y o f l i f e ( Q O L ) a f t e r 6 m o n th s o f t h e r a p y b y d i c l o f e n a c , n a b u m e t o n e , m e l o

11、x i c a m二c e l e c o x i b i n p a t i e n t s w it h r h e u m a t o i d a r t h r i t i s J C h i n P h a r m a c o l B u l l , 2 0 0 4 ， 2 0 ( 6 ) : 6 3 6 一 4 0 . 2 0 v a n d e r P o u w K r a a n T C , v a n G a a l e n F A , e t a l . R h e u m a t o i d a r - t h r i t i s i s a h e t e r o g

12、 e n e o u s d i s e a s e : e v i d e n c e f o r d iff e r e n c e s i n t h e a c t i v a t i o n o f th e S T A T - 1 p a t h w a y b e t w e e n r h e u m a t o i d t is s u e s 仁 J . A rt h ri t is R h e u m, 2 0 0 3 , 4 8 : 2 1 3 2 一 4 5 . 2 1 F r u c h t D M , A r i n g e r M , G a l o n J ,

13、 e t a l . S t a t4 is e x p r e s s e d i n a c t i - v a t e d p e r i p h e r a l b l o o d m o n o c y te s , d e n d r i t ic c e l l s , a n d m a c r o p h a g e s a t s i t e s o f T h i - m e d i a t e d i n f l a m m a t i o n L J . J I m m u n o l , 2 0 0 0 , 1 6 4 : 4 6 5 9一 6 4 . 2 2 Z

14、h o u R , T a n g W, R e n Y X , e t a l . ( 5 R ) - 5 - h y d r o x y t r ip t o l i d e ( L L - D T -8 ) p r e v e n t e d c o l l a g e n - i n d u c e d a rt h r it i s i n D R A / 1 m i c e v i a s u p - p re s s i n g I F N - g a m m a p r o d u c t i o n a n d i t s re l a t e d s i g n a l i

15、 n g 仁 J . J P h a r m a c o l E x p T h e r , 2 0 0 6 , 3 1 8 ( 1 ) : 3 5 一 4 4 . 2 3 S z e k a n e c z Z , K i m J , K o c h A E . C h e m o k i n e s a n d c h e m o k i n e r e - c e p t o r s i n r h e u m a t o i d a r th r i t i s J . S e m i n I m m u n o l , 2 0 0 3 , 1 5 ( 1 ) : 1 5一2 1 .

16、2 4 N e u m a n n E , G a y S , M u l l e r - L a d n e r U . T h e R A N K / R A N K L / o s t e o - p r o t e g e r i n s y s t e m i n r h e u m a t o i d a r th r i t i s ; n e w i n s i g h t s f ro m a n i m a l m o d e l s 仁 J . A r th r it is R h e u m, 2 0 0 5 , 5 2 . 2 9 6 0 一 7 . E s t a

17、b l i s h me n t a n d i n fl u e n c i n gf a c t o r s c o l l a g e n i n d u c e d mu r i n e a r t h r i t i s o f t y p e II mo d e l Z H O U R u , Y A N G Y i - f u , Z U O J i a n - p i n g ( l a b of I m m u n o p h a r rn a c o l o g y , S h a n g h a i I n s t i t u t e of M a t e r i a M

18、 e d ic a , S h a n g h a i I n s t i t u t e s f o r B i o l o g i c a l S c i e n c e s A b s t r a c t : R h e u m a t o i d a r th r i t i s ( R A) i s ， C h i n e s e A c a d e m y of S c ie n c e s , S h a n g h a i 2 0 1 2 0 3 ， C h i n a ) s e r i o u s a u t o i mmu n e d i s e a s e . T y

19、p e II c o l l a g e n i n d u c e d m u r i n e a rt h r i t i s( C I A ) d i s - p l a y s p o l y a rt h r i t i s a n d c a u s e s c h r o n ic a n d d e s t r u c t i v e j o i n t d a m a - g e s , w h i c h i s s i m i l a r t o R A i n m a n y a s p e c t s . C I A i s w i d e l y u s e d f

20、 o r t h e r e s e a r c h o n R A p a t h o g e n e s i s a n d d r u g d i s c o v e ry . I n t h i s r e v i e w , w e d i s c u s s e d t h e e s t a b l i s h m e n t o f C I A a n d t h e k e y f a c - t o r s p a rt i c i p a t i n g in t h e C I A p a t h o g e n e s i s . K e y w o r d s :

21、r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ; c o l l a g e n ; m u r i n e a rt h r i t i s 1 5 3 6 中国药理学通报 C h i n e s e P h a r m a c o l o g i c a l B u l le t i n 2 0 0 6 D e c ; 2 2 ( 1 2 ) Ta b 1 Ti med e p e n d e n t e f f e c t s o f 1 0 0 p A n o l L - t p i o g lit a z o n e a n d 1 0 0 p g L

22、一 T N F - o t o n A d i p o n u t r i n m R N A le v e l s ( T o t a l R N A i s o l a t e d f r o m m a t u re 3 T 3 - L l a d i p o c y t e s a f t e r 6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 a n d 7 2 h , z t s , n 二 3 ) 一-一一一-，.种种种，r，一 . . . . . . . . ， T i me / h G r o u p 勺t 22 4 42 i 7 1 T N F - a C o n t r o l

23、P i o g l i t a z o n e 0 . 6 6士 0 . 0 2 0 . 5 9 1 0 . 0 1 0 . 5 3+0 . 0 8 0 . 6 8 1 0 . 0 1 0 . 6 0 1 0 . 0 1 0 . 4 5 1 0 . 0 1 0 . 8 6 1 0 . 0 1 0 . 6 2士 0 . 0 3 0 . 3 0土 0 . 0 0 0 . 9 2士0 . 0 1 0 . 6 6土0 ( 刃 0 . 2 7 t 0 . 0 1 0 . 9 8 1 0 , 0 1 0 . 6 8 1 0 . 0 5 0 . 2 6士 0 . 0 0 腹股沟、 附翠脂肪和棕色脂肪组织中。

24、本实验拟通过T N F - a , 毗格列酮干预小鼠3 T 3 - L l 细胞株， 以观察不同干预条件 下细胞A d ip o n u t r in m R N A表达的变化。 1 材料与方法 1 . 1 材料 3 T 3 - L l 细 胞株( 中 国 科学院 生科院 细 胞资源中 心) ; T B D特级胎牛血清( 中国医学科学院生物工程研究 所) ; 胰岛素( 诺和诺得公司) ; T N F - 创S i g m a 公司) ; 地塞米 松、 毗格列酮( 江苏涟水制药有限公司) ; T r i z o l ( I N V O T R E - G E N 公司) ; A M V 逆转录酶

25、， O l i g o ( d T ) , R N a s e 抑制剂， T a q 酶， D N A m a r k e r 购自T a K a R a o 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 细胞培养与诱导分化3 7 3 - L l 前体脂肪细胞以l x 1 0 5 接种于6 孔板， 用含1 0 %胎牛血清的D M E M培养液在 3 7 - C , 5 % C O : 的条件下培养， 待细胞生长达6 0 %一 7 0 % o 换含8 6 5 n m o l L 一 胰岛素、 0 . 5 m m o l L 一 1 一 甲 基3 一 异T基 黄嗓吟, 1 0 L m o l L - 地塞

26、米松及1 0 %胎牛血清的D M E M 培养基培养4 8 h ， 接着含8 6 5 n m o l L - 胰岛素的D M E M培 养基培养4 8 h 。随后以1 0 % F B S 的D M E M培养液继续培养， 诱导分化后的3 T 3 - L l 细胞约9 0 %呈脂肪细胞表型， 可用于 研究。 1 . 2 . 2 T N F - a吮格列69对3 1 3 - L 1 脂肪细胞A d i p o n u t r i n m R - N A 表 达 量 的 影 响 以1 0 0 R m o l - L - 毗 格 列 酮和1 0 0 p ,g L 一 T N F - a 分 别处理分化

27、成熟后3 T 3 - L l 脂肪细胞6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 , 7 2 h ， 各 试验条件重复3 次。 1 . 2 . 3 A d i p o n u t r i n m R N A表达的检测 根据G e n e b a n k 中 A d i p o n u tr i n 和(3 - a c t i n ( 肌动蛋白) c D N A序列， 设计两对引 物。 小鼠A d ip o n u t ri n m R N A扩增长度为2 3 4 b y ， 上游引物 5 - C T C T C G G C C G T A T A A T G G A G - 3 ， 下游引物5 -

28、 C G A C T T C G T C T T T G G A A T G G - 3 ; 小鼠p - a c t i n 作为内 参照， 扩增片断长 度3 7 3 b y ， 上游引物5 - G C C A T G T A C G T A G C C A T C C A - 3 ， 下游 引物5 - A A C C G C T C A T T G C C G A T A G T - 3 o P C R 反应体系中包 含A d i p o n u t ri n 上下游引物各2 0 R m o l L - 1 , p - a c t i n 上下游 引 物 各2 0 p ,m o l L -

29、1 ， 反应体系达5 0 闪 。 R T - P C R 产物经 1 . 5 %琼脂糖凝胶电泳成像( 5 V / c m ) 和光密度分析。以A d i - p o n u t ri n 与(3 - a c t i n 光密度比值表示3 T 3 - L l 脂肪细胞A d i p o - n u t r i as m R N A表达量。 1 . 2 . 4 统计分析 实验数据以x 1 、 表示， 两组间比较用配 对， 检验; 3 组比较用单因素方差分析( A N O V A ) 和T u k e y H S D 检验; 以上统计均用S P S S 1 1 . 0 完成。 2 结果 2 . 1

30、A d i p o n u t r i n m R N A 表达 未 分化的3 T 3 - L 1 脂肪细胞 中， A d i p o n u t ri n m R N A表达水平很低， 只有 0 . 1 3 1 0 . 0 1 o 3 T 3 - L l 脂肪细胞成熟后， A d i p o n u t r i n m R N A表达水平随时间 递增， 成熟后7 2 h 的表达水平最高。 2 . 2 分化成熟后不同干预条件对A d i p o n u t r i n m R N A表达 量的 影响 见T a b 1 。 与 对照组相比， 以1 0 0 N .m o l “ L - 毗格 列酮

31、处理分化成熟后的3 T 3 - L l 脂肪细胞6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 , 7 2 h , A d i p o n u t ri n m R N A水平分别比对照组减少1 0 . 2 % , 1 5 . 9 %, 5 1 . 8 %, 5 7 . 4 %, 6 1 . 2 %( P 0 . 0 1 ) 。 而1 0 0 p g L 一 T N F - (x 干预分化成熟后3 T 3 - L l 脂肪细胞6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 , 7 2 h , A d ip o - n u t ri n m R N A表达分别提高了 1 1 . 2 %, 1 3 . 2 %,

32、3 8 . 1 %, 4 0 . 5 %, 4 3 . 7 %( P 0 . 0 5 ) 。 3 讨论 A d i p o n u t ri n 是一种由4 1 3 个氨基酸 组成的膜 蛋白， 分子 量约为4 8 k u , 多重 序 列 分析 揭 示A d ip o n u t ri n 家 族 在真核生 物中 具有同 源性和高度保守性， 而A d i p o n u t ri n 的 功 能目 前并 不清楚。因 此， 本实验选择胰岛素抵抗相关因子T N F - 。干预 3 T 3 - L 1 脂肪细胞， 以观察它对A d i p o n u t ri n 表达的影响。 B a u la n

33、 d 。 等 发 现， A d ip o n u t ri n m R N A 的 表 达 与 细胞 分 化有着紧密联系。本实验表明在成熟脂肪细胞中A d i p o n u - t ri n m R N A的表达明显高于其前体脂肪细胞， 结果与前者一 致。 本研究还发现在未分化细胞中A d ip o n u t ri n m R N A存在 少量表达; 在高葡萄糖培养条件下， 细胞分化成熟后， 它的表 达量呈上升趋势。 有研究发现曲格列酮可抑制成熟后3 T 3 - L l 细胞中A d i - p o n u t n n 的 表 达 z 7 ， 本实 验的 结果与其相似。目 前 毗格列酮 抑

34、制A d i p o n u t r i n m R N A的 机制还不明确， 有研究提 示A d i p o - n u t ri n m R N A 可 能 是T Z D ， 作用的 新靶点 ， 。 尽管A d ip o n u - t ri n 为非分泌蛋白， 但其仍表现出某些脂肪细胞因 子的特征: 对Z u c k e r ( f a / f a ) 肥胖大鼠的研究也提示， A d i p o n u tri n 的表达 量比 对 照 组 提 高了3 0 一 5 0 倍 。 但对肥 胖妇女 和 非 肥胖妇 女的 观 察 3 却 发 现A d i p o n u t ri 。 与 空 腹

35、葡 萄 糖成负 相 关， 随 着 A d ip o n u t ri n m R N A 的 增 加， 胰岛 素 敏 感 度 增 加。 几 种 研究 结 果似乎存在矛盾。本研究通过T N F - 。作用于分化成熟后的 3 T 3 - L 1 细胞， A d i p o n u t ri n m R N A 的 水平 逐 渐提高。 总之， 本实验通过对体外不同 条件下的A d ip o n u tr i n m R - N A 表 达水 平的 观察， 提 示毗格列酮， T N F - a 可影响A d i p o n u - t r i n m R N A的表达， 对阐明A d ip o n u

36、 t ri n m R N A的生理功能有 着积极的意义， 但尚需进一步的动物实验和临床研究来剖析 A d i p o n u t ri n m R N A的生 理作用。 参考文献: 川B a u l a n d e S , L a s n i e r F , L u c a s M , e t a l . A d ip o n u t r in , a t r a n s m e m - b r a n e p r o t e i n c o r r e s p o n d i n g t o a n o v e l d ie ta ry - a n d o b e s i t y - l

37、i n k e d m R N A s p e c if i c a l l y e x p r e s s e d i n t h e a d i p o s e l i n e a g e 【 J . J B i o l C h e m, 2 0 0 1 , 2 7 6 ( 3 6 ) : 3 3 3 3 6 一 4 4 . 2 P o l s o n D , T h o m p s o n M . A d i p o n u t r i n g e n e e x p r e s s i o n i n 3 T 3 - L 1 a d i p o c y t e s i s d o w

38、n r e g u l a t e d b y t ro g l i t a z o n e J . H o r m M e t a b R e s , 2 0 0 3 , 3 5 ( 8 ) ; 5 0 8 一 1 0 . 3 L i u Y M , M o l d e s M , B a s t a r d J P , e t a l . A d i p o n u t r i n ; A n e w g e n e r e g u l a t e d b y e n e r g y b a l a n c e i n h u m a n a d i p o s e t i s s u e 川 . J C l in E n d M e t , 2 0 0 4 , 8 9 ( 6 ) ; 2 6 8 4 一 9 .