体外柴胡皂苷元d对C6大鼠神经胶质瘤细胞前列腺素E2生成的影响.pdf

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1、8 2 4 中国药 理学通报 C h i n e s e P h a r m a c o l o g ic a l B u ll e t in 2 0 0 4 J u l ; 2 0 ( 7 ) ; 8 2 4 - 6 体外柴胡皂普元d 对C 6 大鼠神经胶质瘤 细胞前列腺素E : 生成的影响 吕晓川， 白林， 王晓蕾 ( 解放军总医院药检室， 北京1 0 0 8 5 3 ) 中国圈书分类号: R - 3 3 2 ; R 2 8 2 . 7 1 ; R 2 8 4 . 1 ; R 3 4 7 ; R 7 3 0 . 2 6 4 ; R 9 7 1 . 4 3 ; R 9 7 1 . 9 文献标

2、识码; A 文章编号; 1 0 0 1 一 1 9 7 8 ( 2 0 0 4 ) 0 7 一 0 8 2 4 一 0 3 摘要: 目 的 观察柴胡皂昔元d ( s a i k o g e n i n d , S G D ) 对C 。 大 鼠神经胶质瘤细胞体外前列腺素 E Z ( P G E Z ) 生成的影响。 方法 用放射性免疫法测定细胞产生的P G E Z ， 液体闪烁测 量法测定 4 C 花生四烯酸( A A ) 标记细胞释放 C - A A 。结果 S G D 在1 一 2 0 L m o l “ L - 范围内， 抑制由 钙离子载体 A 2 3 1 8 7 诱发C 6 大鼠神经胶质

3、瘤细胞前列腺素E Z ( p r o s t a - g l a n d in E 2 1 P G E Z ) 释放， 其I C 、 为3 L m o l L - 1 ， 但对花生四 烯酸( a r a c h i d o n i c a c i d , A A ) 释放无影响。S G D不影响细胞 微粒体组分将A A 转化为P G E Z 。结论 S G D 抑制由钙离子 载体A 2 3 1 8 7 诱发体外C 。 大鼠 神经胶质瘤细胞P G E : 产生， 但不抑制 A A释放和直接抑制环氧脂酶( c y c l o o x y g e n a s e , C o x ) 活性。 关键词:

4、 柴胡皂昔元 d ; 前列腺素 E Z ; 环氧脂酶; 花生四烯 酸; C 。 大鼠神经胶质瘤细胞 柴胡是我国常用的传统中药， 其药性味苦， 微 寒， 归肝、 胆经。功能解表退热， 舒肝解郁， 升举阳气 等川。 根据现代研究， 柴胡具有抗炎、 免疫调节和 抑制纤维细胞增生等作用。柴胡皂昔是柴胡的有效 成分， 有 1 0 余种， 其中生物活性较强的有柴胡皂昔 a , b , 。 和d 等， 其中又以柴胡皂昔d的抗炎作用最 强川。 柴胡 皂昔d 经口， 给药， 在胃 酸和肠道菌群 的作用下， 转变为柴胡皂昔元 d ( S a i k o g e n i n d , S G 功， 吸收进人血液3 1

5、 。星形细胞在引起和调控 中枢神经系统的炎性反应中起重要作用， 激活的星 形细胞释放炎性介质如细胞白介素 1 R和前列腺 素川。由 于前列腺素及其相关合成酶在肌萎缩侧 索硬化症( a m y o t r o p h i c l a t e r a l s c l e ro s i s , A L S ) 和阿尔 采末 病( A l z h e i m e r s d is e a s e , A D ) 中 升高 ， 。 星形 细胞释放的前列腺素E , ( P r o s t a g l a n d i n E , , P G E , ) 可 收稿日期: 2 0 0 3 - 1 2 - 0 3

6、 ， 修回日 期: 2 0 0 4 - 0 2 - 0 7 作者简介: 吕 晓川( 1 9 6 2 一 ) ， 男， 副主任药师， 研究方向: 天然药物分 析，T e l : 0 1 0 -6 8 1 6 3 6 3 9 ，F a x ; 0 1 0 . 6 8 1 6 3 6 3 9 , E - m a i l ; l v x c 2 0 0 2 y a h o o . c o m . e n 能引 起炎 性反 应而 损害中 枢神 经系 统” 。 C 。 细 胞， 来源于大鼠 神经胶质瘤仁 1 ， 常作为神经胶质细胞研 究模型。本文就S G D对C 6 大鼠神经胶质瘤细胞体 外前列腺素E 2

7、 ( P ro s t a g l a n d i n E 2 , P G E , ) 生成的影 响， 报道如下。 1 材料和方法 1 . 1 药品和试剂D u l b e c c o 改良细胞培养基( d u l - b e c c o s m o d if i e d e a g l e m e d iu m ， D M E M ) 和E a g l e 细 胞培养基( E a g l e s m in im u m e s s e n t i a l m e d iu m ， E M E M)为N i s s u i P h a r m a c e u t i c a l C o . L

8、 t d .( T o k y o ， J a p a n ) 产品; 胎牛血清( F C S ) 为 G e n e r a l S c i e n t i f i c L a b o r a t o ry 产品( L o s A n g e l e s , C A , U S A ) ; 马血清为 D a i n i p p o n p h a r m a c e u t i c a l ( T o k y o , J a p a n ) 产品; S G D 由T s u m u r a 花生四 烯 酸( A r a c h i d o n i c a c i d ， A A ) , 2

9、一 4 一 ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) - 1 - p i p e r a z i n y l e t h a n e s u l f o n i c a c i d( H E P E S )、 F - 1 0 H A M培养 基和牛白 蛋白 均购自S i g m a 公司; 3 H - P G E 2 ( 7 . 4 x 1 0 “ B q m o l 一 ) ， 3 H 肌醇和 14 C I 花生四烯酸为D u P o n t/ N E M产品; P G E : 及其抗体来 自 O n o P h a r m a c e u t i c a l C o

10、. L t d . ( O s a k a , J a p a n ) ; A 2 3 1 8 7 为M e r c k ( T o k y o , J a p a n ) 产品; 其他试剂为 分析纯或更高级别。 1 . 2 细胞培养 C 。 大鼠 神经胶质瘤细胞由日 本东 北大学 N a k a h a t a N o r i m i c h i 教授惠赠， 调整 C 6 细胞 浓度1 . 0 x 1 0 8 c e ll L 一 ， 于1 2 孔的 细胞培养皿中， 加人F - 1 0 H A M完全培养基内含: 体积分数 1 5 %经 热处理失活的马血清、 体积分数2 . 5 % F C

11、S , 1 . 0 x 1 0 5 U L 一 青霉素、 1 0 0 m g L 一 链霉素， 置含体积 分数5 % C 0 2 , 9 5 %湿润空气孵箱中， 3 7 孵育4 8 h o 1 . 3 P G E : 测定细胞用含2 0 m m o l “ L - H E P E S 的E M E M培养基( p H 7 . 3 5 ) 洗涤2 次， 加此培养基， 细胞于3 7 孵育1 0 m i n 后， 加药物刺激 1 0 m i n ， 再 加1 0 a,m o l L - A 2 3 1 8 7或培养基继续孵育 1 0 m i n ， 取出培养基， 置冰浴中装有叫噪美辛( 最终浓 度为

12、5 0 R m o l L 一 ) 和E D T A ( 最终浓 度为5 m m o l L - 1 ) 的 玻璃试管中， 终止反应。 反应液用1 m o l 万方数据 中国药理学通报C h i n e s e P h a r m a c o l o g i c a l B u l l e t i n 2 0 0 4 J u l ; 2 0 ( 7 ) 8 2 5 T a b 1 E ff e c t o f S G D o n P G E Z p r o d u c t i o n i n c u l t u r e d C 6 c e l l s t r e a t e d w i t h

13、 o r w i t h o u t A 2 3 1 8 7 1 0 l a n o l L 一 t ( x t s , 。 二 9 ) G ro u p D r u g s / FL m o l L 一 I P G E Z p ro d u c ti o n / % 1 6 . 4 5 7士7 . 9 6 1 1 0 0 飞公00，.且八创户，.、 3459%70055221 - 八，8006月Iljn， 士士土土士士士 t 1 0 . 士 1 2. 1 4 9. 6 2 6二 3 6 4. 769095213969941255265762122 L - 的 盐酸 调p H为4 . 0 ,

14、P G E Z 用乙 酸乙 醋提取， 提 取液氮气下吹干， 残渣用1 0 m m o l L 一 T r i s 一 盐酸液 ( p H 7 . 6 ) 溶 解， 用 放 射 性 免 疫 法! 测 定P G E Z 1 . 4 A A释放的测定细胞用含14 C - A A ( 1 . 1 1 x 1 0 7 B q L 一 ) 的D M E M培养基3 7 0 C孵育1 8 6 后， 用 T y r o d e 溶液( 含N a C I 1 3 7 m m o l L 一 ; K C l 2 . 7 m m o l L 一 I ; M g C I Z 1 . 0 m m o l L 一 t ;

15、 C a C l 2 1 . 8 m m o l L 一 ; 葡萄 糖5 . 6 m m o l L 一 ; H E P E S ( 含3 g L 一 牛 白 蛋白 ) 2 0 m m o l “ L - t ; p H 7 . 3 5 ) 洗涤2 次， 加此溶 液， 细胞于3 7 0 C 孵育 1 0 m i n 后， 加药物刺激或不加 药物孵育1 0 m i n ， 再加1 0 L m o l L 一 A 2 3 1 8 7 或培 养基继续孵育 1 0 m i n ， 取出培养基， 置冰浴中装有叫 噪美 辛( 最终浓度为5 0 p ,m o l L 一 ) 和E D T A ( 最终 浓度

16、为5 m m o l L 一 ) 的玻璃试管中， 终止反应。将 反应液涡流混匀， 4 9 C , 1 8 0 0 x g 离心5 m i n ， 取上清 液0 . 1 m l 用液体闪 烁测量法测定a C - A A释放。 1 . 5 细胞微粒体组分将A A转化为P G E : 按文 献 “ 报道的 方法略做改动测定细胞微粒体组分将 A A 转化为P G E 2 ， 简述如下: 细胞用5 0 m m o l L - 1 T ri s 缓冲液( p H 7 . 4 ) 溶液洗涤2 次， 加含 1 m m o l L - 1 E D T A 的5 0 m m o l L - T ri s 缓冲液剥

17、离细胞， 用超声波( 2 0 k H z , 5 s x 3 ) 将收集的细胞完全破坏。 样品液4 C , 1 8 0 0 x g离心5 m i n ， 取上清液， 4 9 C , 3 5 8 0 0 x g 离心6 0 m i n ， 取 沉淀 物 用含2 p L m o l L 一 血红素， 5 m m o l L 一 色氨酸的5 0 m m o l L 一 T ri s 缓冲液溶解得反应混合物。此反应混合物加药物或 不加药物于3 7 c C 孵育1 0 m in 后， 再加2 0 L m o l L 一 A A 继续孵育4 0 m i n ， 加冰冷A 引 噪美辛5 0 L m o l

18、。 L 一 和E D T A 5 m m o l L 一 ， 终止反应。 反应液用1 m o l L - 的 盐酸调p H为4 . 0 , P G E : 用乙酸乙 醋提 取， 提取液氮气下吹干， 残渣用1 0 m m o l L 一 T r i s - 盐酸液( p H 7 . 6 ) 溶解， 用放射性免疫法 9 测定 P G E Z 。 1 . 6 统计学处理结果以无 土 ， 表示， 组间行单因 素方差分析。 2 结果 2 . 1 S G D抑制由 钙离子载体A 2 3 1 8 7 诱发C 大鼠 神经胶质瘤细胞P G E : 释放 分别以1 , 2 , 5 , 1 0 , 3 0 L m

19、o l L - S G D刺激细胞， 再加1 0 L m o l L - 1 A 2 3 1 8 7或不加 A 2 3 1 8 7继续孵育 1 0 m i n ， 未加 A 2 3 1 8 7 , P G E : 释放量小， 且各剂量组间差别不大， 加A 2 3 1 8 7 , P G E : 释放量明显升高， S G D对A 2 3 1 8 7 所致的P G E : 释放升高具有抑制作用， 此作用呈剂 量依赖性， 其I C S。 为3 L m o l L 一 ( T a b 1 ) 。 . 6 8 2士1 0. 231418.12149364483220 101251020251020 C

20、o n t rol A 2 3 1 8 7 S GD A 2 3 1 8 7+S GD . P 0 . 0 5 ，“ P 0 . 0 1 “A 2 3 1 8 7 . A 2 3 1 8 7 - i n d u c e d P G E Z p ro - d u c t i o n i s t a k e n a s 1 0 0 % 2 . 2 S G D对A A释放无影响 用“ C - A A 标记的细 胞于3 7 c C 孵 育1 0 m i n 后， 加2 , 5 , 1 0 N L m o l L 一 S G D 或 培 养基孵 育1 0 m i n ， 再加1 0 L m o l L

21、一 A 2 3 1 8 7 或培养基继续孵育1 0 m in ， 未加A 2 3 1 8 7 , 4 C - A A 释 放量小。加A 2 3 1 8 7 , 14 C - A A释放量明显升高， 加 S G D的细胞与未加的细胞比 较， 14 C - A A释放量差异 无显著性， 且S G D各剂量组间差异也无显著性。说 明S G D ( 2 一 1 0 L m o l L 一 ) 对A A 释 放 无影响( T a b 2 ) 。 T a b 2 E ff e c t o f S G D o re A A r e l e a s e f r o m c u l t u r e d C 6

22、c e l l s t r e a t e d w i t h o r w it h o u t A 2 3 1 8 7 1 0 p m o l L 一 ， ( x 3 s , n 二 6 ) D r u g s / l t ,m o l L 一 A A re l e a s e C o n t rol A 2 3 1 8 7 S GD A 2 3 1 8 7+S GD 1 2 . 8 1 9 t 0 . 2 8 2 3 . 0 9 4 10 . 2 1 7 3 . 5 4 2土0 . 2 4 6 3 . 8 3 1土0 . 3 0 4 0 . 8 6 7 1 0 . 1 4 5 102510

23、10 D a t a w a s e x p re s s e d a s f o l d o f c o n t ro l w it h o u t d r u g t re a t m e n t T a b 3 Eff e c t o f S GD a n d i n d o me t h r i - o n t h e c o n v e r s i o n o f AA t o P G E 2 i n m i c ro s o m a l p r e p a r a t i o n s o f C 6 c e ll s ( 无 土 s , n 二 6 ) D r u g s / p

24、m o l L 一 P G E 2 p r o d u c t i o n 1 1 . 0 2 4 1 10 . 的 以 1 . 0 4 8 2 t 0 . 0 7 5 3 1 . 0 6 9 3:0 . 0 9 0 2 1 . 0 0 9 1 10 . 0 4 8 2 0 . 9 3 3 7 10 . 0 3 0 1 0 . 9 7 8 9 1 0 . 1 0 2 4 0. 9 4 01 10 . 0 7 3 5 0 . 2 7 1 1 1 0 . 0 9 0 4. 0 . 1 8 6 7 1 0 . 0 2 4 1 ， 1251020501拍50 C o n t rol S GD I n

25、d o me t h c i n . P 0 . 0 5“c o n t ro l . D a t a w a s e x p re s s e d a s f o l d o f c o n t ro l w i t h o u t d r u g t r e a t m e n t . 万方数据 8 2 6 中国药理学通报C h i n e s e P h a r m a c o l o g i c a l B u l l e t i n 2 0 0 4 J u t ; 2 0 ( 7 ) 2 . 3 S G D不影响细胞微粒体组分将 A A转化为 P G E Z细胞微粒体组分( 9 0

26、w g 管一 ) 与1 , 2 , 5 , 1 0 , 2 0 , 5 0 N L m o l L 一 S G D 或1 ， 1 0 , 5 0 L m o l L 一 “ 引 噪 美 辛3 7 9 C 孵育1 0 m i n 后， 再加2 0 L m o l L 一 A A 继续孵育4 0 m i n , S G D各剂量组间产生的P G E Z 与 阴性对照( 不加任何药物) 组无显著差别， 而A i l 噪美 辛( 1 0 , 5 0 N L m o l L - 1 ) 明显抑制P G E Z 生成( T a b 3 ) 。 3 讨论 P G E : 参与免疫调控， 在炎性反应中起重要作

27、 用 ” ，” 。 前列腺素的合成始于磷脂酶A 2 ( p h o s p h o - l i p a s e A 2 , P L A Z ) , P L A : 使A A从膜磷脂中 释放， A A 在环氧脂酶( c y c l o o x y g e n a s e , C O X ) 和前列腺素合成 酶的作用下， 生成P G E Z 。已知抗炎药物如阿斯匹林 抑 制C O X 活 性 12 1 。 本实验 证明， S G D ( 1 一 2 0 H L m o l “ L - 1 ) 不影响C 。 大鼠神经胶质瘤细胞基础水平 P G E Z ， 但剂量依赖性地抑制由钙离子载体A 2 3 1

28、 8 7 诱发P G E Z 释放， I C S。 为3 p L m o l L 一 。 S G D的这一 作用可部分解释其抗炎药理作用。由于此浓度的 S G D即不影响A A释放， 也不影响细胞微粒体组分 将A A转化为P G E 2 ， 因此， 我们认为S G D抑制由钙 离子载体 A 2 3 1 8 7 诱发 C 6 大鼠神经胶质瘤细胞 P G E : 释放， 不是通过抑制A A释放或直接抑制C o x 活性实现的， 其机制有待进一步研究。 参考文献: 1 冉先德.中华药海仁 M . 哈尔滨: 哈尔滨出版社， 1 9 9 3 : 8 5 . 2 张相年。 张相波. 柴胡皂贰的生理活性及在

29、治疗肾病中的应用 仁 M 广东药学学报， 2 0 0 0 , 1 6 : 1 2 1 . 3 K iij i S h i m i z u , S a k a e A m a g a y a , Y u k i o O g i h a r a . Q u a n t i t a t i v e a n a l - y s is o f t h e m e t a b o l i t e s o f s a i k o s a p o n i n a u s i n g h i g h - p e r f o r m a n c e l iq u i d c h ro m a t o gr a p

30、 h y 仁 J . J C h r o m a t o g r , 1 9 8 4 , 3 0 7 : 4 8 8 一 9 2 . 4 D a y t o n E T , M a j o r E O . R e c o m b i n a n t h u m a n i n t e r l e u k in 1 b e t a i n - d u c e s p r o d u c t io n o f p ro s t a g l a n d i n s i n p r i m a ry h u m a n f e t a l a s t ro - c y t e s an d i m m

31、 o rt a l i z e d h u m a n f e t a l a s t ro c y t e c u l t u r e s J . J N e u - r o i m m u n o l , 1 9 9 6 , 7 1 ( 1 一 2 ) : 1 1 一 8 . 5 王庆利， 刘耕陶. 炎性细胞因子与阿尔采末病仁 J .中国药理 学通报， 2 0 0 2 , 1 8 ( 1 ) : 1 一 5 6 M o n t i n e T J , S i d e l l K R , C r e w s B C e t a l . E l e v a t e d C S F p ro s

32、 t a g l a n - d i n E 2 l e v e l s i n p a t i e n t s w i t h p ro b a b l e A D J . N e u r o l o g y ， 1 9 9 9 , 5 3: 1 4 9 5一8 . 7 T e a t h e r L A , L e e R K K , W u rt m a n R J . P l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c to r i n - c re a s e s p ro s t a g la n d i n E 2 re l e a s e f

33、 ro m a s t ro c y t e - e n r i c h e d c o rt i c a l c e l l c u l tu r e s J . B r a i n R e s e a r c h , 2 0 0 2 , 9 4 6 : 8 7 一 9 5 . 8 B e n d a P , L i g h t b o d y J , S a t o G e t a l . D iff e r e n t i a t e d r a t g l ia l c e l l s t r a i n i n t is s u e c u l t u re J . S c ie n

34、 c e , 1 9 6 8 , 1 6 1 : 3 7 0 一 1 . 9 N a k a h a t a N , I m a t a K , O h k a w a T e t a l . M a s t o p a r a n e l ic it s p r o s t a - g l and i n E 2 g e n e r a t i o n and i n h i b i t s i n o s i t o l p h o s p h a t e a c c u m u l a t i o n v i a d i ff e re n t m e c h a n i s m s i

35、 n r a b b i t a s t r o c y t e s J . B i o c h e m B io p h y s A c t a , 1 9 9 6 , 1 3 1 0 : 6 0一 6 . 【 1 0 M a n c i n i J A , R i e n d e a u D , F a l g u e y re t J P , e t a l . A r g i n i n e 1 2 0 o f p ro s t a g l a n d in G / H s y n t h a s e - 1 i s re q u i r e d f o r t h e i n h i

36、 b i t i o n b y n o n - s t e ro i d a l a n t i - i n fl a m m a t o ry d r u g s c o n ta i n i n g a c a r b o x y l i c a c i d m o i e - t y 仁 J . J B i o l C h e m, 1 9 9 5 , 2 7 0 : 2 9 3 7 2 一 7 . 川K u r o d a E , Y a m a s h i t a U . R e g u l a t io n o f i m m u n e r e s p o n s e s b

37、y p ro s - t a g l a n d i n J . J U O E H , 2 0 0 2 , 2 4 ( 3 ) : 2 8 9 一 9 9 . 1 2 Wil l i a m s C S , D u B o i s R N . P r o s t a g l a n d in e n d o p e ro x i d e s y n t h a s e : W h y tw o i s o f o r m s J . A m J P h y s io l , 1 9 9 6 , 2 7 0 ( 3 P t 1 ) : G 3 9 3 - 4 0 0 . E f f e c t

38、 o f s a i k o 2 e n i n d o n p r o s t a g l a n d i n E , ( P GE , ) 石 ， J月 L. J日 白、J 白 ， p r o d u c t i o n i n v i t r o i n C 6 r a t g l i o ma c e l l s L U X i a o - c h u a n ， B A I L i n , WA N G X i a o - l e i ( D e p t o f D r u g A n a l y s is , P L A G e n e r a l H o s p i t a l

39、, B e ij i n g 1 0 0 8 5 3 , C h i n a ) A b s t r a c t : A i m T o s t u d y t h e e f f e c t o f s a i k o g e n i n d ( S G D ) o n p r o s t a g l a n d i n E Z ( P G E Z )p r o d u c t i o n i n C 6 r a t g l i o m a c e l l s . Me t h o d s R a d i o i m m u n o a s s a y w a s a p p l i e d

40、 t o d e t e r m i n e P G E Z p r o d u c t i o n i n t h e c e l l s . S c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g w a s u s e d t o m e a s u r e l i b e r a t i o n o f 14 C - a r a c h i d o n i c a c i d( A A )f r o m t h e c e l l s l a b e l e d w i t h仁 14 C 一 A . R e s u l t s I n v i t r o

41、， S G D a l o n e a t 1 - 2 0 t m o l L 一 d i d n o t a f f e c t P G E Z r e le a s e f r o m c e ll s ， b u t i n h i b i t e d i t s r e l e a s e i n d u c e d b y A 2 3 1 8 7 ， a C a 2 + i o n o p h o r e . T h e i n h i b i t i o n w a s c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d - e n t ， w it h

42、 th e I C s , v a lu e o f a b o u t 3 L m o l L 一 1 . S G D ( 2一1 0 L m o l L 一 )h a d n o in h i b i t o ry e f f e c t o n A 2 3 1 8 7 - i n d u c e d A A r e l e a s e o r o n t h e c o n v e r s i o n o f A A t o P G E Z i n m i c r o s o m a l p r e p a r a t i o n s . C o n c l u s i o n S G

43、D i n h i b i t e s A 2 3 1 8 7 - i n d u c e d P G E Z p r o d u c t i o n i n C , r a t g l i o m a c e l l s i n v i t r o ，w i t h o u t e i t h e r i n h i b i t i o n o f f r e e A A l i b e r a t i o n o r a d i r e c t i n h i b i t i o n o f c y c l o o x y g e n - a s e( C O X ) a c t i v i t y . K e y w o r d s :s a i k o g e n i n d ;p r o s t a g l a n d i n E Z ;a r a c h i - d o n i c a c i d ; c y c l o o x y g e n a s e ; C , r a t g l i o m a c e l l s 万方数据