实验性脑出血后大鼠神经细胞凋亡与NF-κB的表达.pdf

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1、论著 2 0 1 0 年2 月第7 卷第5 期 实验性脑出血后大鼠神经细胞凋亡与N F K B 的表达 吴丹滕伟禹 ( 中国医科大学附属第一医院神经内科，辽宁沈阳1 1 0 0 0 1 ) 【摘要】目的：研究实验性脑出血后大鼠神经细胞凋亡与N F K B 表达的动态变化，并初步探讨两者的关系。方法：将、 大鼠随机分为脑出I I I L 组、假手术组和对照组，应用立体定向技术将自体不凝血注入大鼠尾状核制备脑出血模型，大 鼠分别在不同时间点断头取脑连续冠状切片做T U N E L 染色和N F K B 免疫组化染色。结果：凋亡细胞在脑出m 后 6h 出现。1d 后开始增多。3d 达到高峰，并持续到

2、7d 仍有表达，并且与N F K B 的表达变化一致，各组与对照组比 较，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。脑出血后T U N E L 阳性细胞与N F K B 的表达呈正相关( r = 0 9 5 7 ，P O 0 1 ) 。结论：脑 出血后存在细胞凋亡，且可能与N F K B 的激活有关。 【关键词1 大鼠；脑出血；凋亡；N F K B 【中图分类号】R 一3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 3 7 2 1 0 ( 2 0 1 0 ) 0 2 ( b ) 一0 1 8 - 0 3 A p o p t o s i so fn e u r o c y t e sa n de

3、x p r e s s i o no fN F - K Bi nr a tb r a i na f t e re x p e r i - m e n t a li n t r a c e r e b r a Ih e m o r r h a g e 形UD a n , T E N G 形e o m + ( D e p a r t m e n to fN e u r o l o g y ，t h eF i r s tH o s p i t a lo fC h i n aM e d i c a lU n i v e r s i t y ，S h e n y a n g 11 0 0 01 ，C h

4、 i n a ) 【A b s t r a c t 】O b j e c f i v e ：T os t u d yt h ed y n a m i cc h a n g eo ft h ea p o p t o s i so fn e u r o c y t e sa n dt h ee x p r e s s i o no fN F K Ba f t e re x - p e r i m e n t a li n t r a c e r e b r a lh e m o r r h a g e ( I C H ) i nr a t sa n di n v e s t i g a t et

5、h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e m M e t h o d s ：T h er a t sw e r e r a n d o m l yd i v i d e di n t oI C Hg r o u p ，s h a mg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p I C Hr a tm o d e l sw e r ep r e p a r e dw i t hs t e r e o t a e t i ei n f u s i o no f a u t o l o g o u sb l o o di n

6、 t oc a u d a t en u c l e u s T h eb r a i n so fr a t sw e r eg o t t e no f fa td i f f e r e n tt i m e sa n ds u c c e s s i v ec o r o n a ls l i c ew a s m a d ea n dt h e ns t a i n e d T h ea p o p t o s i so fn e u r o c y t e sa n dt h ee x p r e s s i o no fN F - K Bw e r ed e t e c t e

7、dr e s p e c t i v e l yb yT U N E L a n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys t a i n i n g R e s u l t s ：A p o p t o s i sc e i l sa p p e a r e da t6ha f t e rI C H ，s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da f t e r1d ， r e a c h e dp e a ka t3 da n dc o n t i n u e dt o7d a n ds h o w e d

8、s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ( P 0 0 5 ) T h ee x p r e s s i o no fN F - K Bc h a n g e da 8t h ea p o p t o s i s T h en u m b e ro fT U N E Lp o s i t i v ec e l l sw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h ee x p r e s - s i o n

9、o fN F - K B ( 间9 5 7 ，P 0 0 1 ) C o n c l u s i o n ：A p o p t o s i se x i s t si nt h eb r a i nt i s s u ea f t e rI C Ha n di sr e l a t e dt ot h ea c t i v a t i o n o fN F - K B p o s s i b l y 【K e yw o r d s 】R a t s ；I n t r a e e r e b r a lh e m o r r h a g e ( I C H ) ；A p o p t o s i

10、s ；N F K B 脑出I I I L 是神经系统常见病，出血后继发性损害导致的神 经细胞死亡具有莺要临床意义，细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 作为一 种基因i | 封控的细胞死亡方式H 丁能为其中的一个重要环节。陈 吉相等研究发现，假手术组偶见凋亡细胞，表明正常脑组织 一般不发生细胞凋亡；脑出f I I L 后凋亡细胞数明显增多据此认 为细胞凋亡是脑出I I I L 周围组织损伤的一个标志在一定程 度上反映了其受损伤的程度。核因子一K B ( n u c l e a r f a c t o r k a p p a B ，N F K B ) 是一种广泛存在、功能多样的核转

11、录因子，参与多 种炎症相关基因的表达和调控 2 1 。近年来的研究显示，N F K B 在中枢神经系统中广泛存在玎丁见于大脑皮质、海马和小脑 突触，神经元、神经胶质细胞与血管内皮细胞中均有表达p 1 。 目前关于脑出I f L 后血肿周围组织N F K B 表达的研究甚少。 本实验应用立体定向技术将自体不凝血注入大鼠尾状核制 备脑出J I I L 模型。用T U N E L 染色观察神经细胞凋亡，用免疫组 通讯作者 化染色观察N F K B 的表达，并初步探讨脑出血后神经细胞凋 亡与N F K B 表达的关系。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 实验动物及分组 健康雄性S D 大鼠4

12、5 只，体重2 5 0 N 3 0 0g ，由中国医科大学 实验动物中心提供。将大鼠随机分为脑出血组和假手术组，分别 按6h 、1d 、3d 、7d 分为4 个亚组，每组5 只；另设对照组5 只。 1 1 2 试剂与器材 N F K B p 6 5 兔抗鼠多克隆抗体、即用型S A B C 免疫组化 试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉博十德生物T 程有 限公司；动物头颅立体定位仪( S N 一2 ，N A R I S H I G H E ，日本) ； 微量注射器( 上海激光医学仪器厂) ；电子分析天平( B P 2 1 1 D ， 赛多利斯，德国) ；O L Y M P U S 光学显微镜(

13、日本) ；图像分析仪 ( M e t a m o r p hI m a g eS y s t e mV 4 6V I C ，美尽J ) ；紫外分光光度仪 药理与临床2 0 0 8 。2 4 ( 6 ) ：5 3 【9 】刘隽中医药为主治疗咳嗽变异性哮喘4 0 例【J 】中国巾医急症，2 0 0 6 ，1 5 ( 1 2 ) ：1 3 7 9 【1 0 】王姗姗瓜萎皮的药理作用及其临床应用【J 】- 山西医药杂志，2 0 0 9 ，3 8 ( 1 ) ：6 7 18 巾国医药g 报C H I N AM E D I C A LH E R A L D 【1 I 】邵禾蓝，曹岗，熊耀康甘草生物活性研究

14、的某些新进展叨中国实用 医药, 2 0 0 9 州1 3 ) ：2 2 8 【1 2 】壬丽荣，李杰，董永军，等甘草多糖对小鼠生长性能及细胞免疫能力 的影响【J 】西北农业学报, 2 0 0 7 ，1 6 ( 1 ) ：2 2 6 - 2 2 8 ( 收稿1 3 期：2 0 0 9 1 2 1 6 ) 万方数据 2 0 1 0 年2 月第7 卷第5 期 ( U V 3 0 0 ，S p e s t r o n i cU n i c a m ，美国) 。 1 2 方法 1 2 1 大鼠脑出血模型的制作 将大鼠用1 0 水合氯醛( 3 0 0m g k g ) 腹腔注射麻醉后， 用微量注射器从大鼠

15、右侧股动脉抽取7 0 一血。在立体定位 仪引导下将5 0 l 血缓慢注入右侧尾状核( 前囟前0 2m m ， 中线右旁3 0m l n 处) 。进针6m m 留针1 0r a i n 后退针。假手 术组注入5 0 斗l 生理盐水，其他操作同实验组。对照组不给 予任何处置。术后观察大鼠的行为改变。给水、给食饲养。根 据实验计划在不同时间点将大鼠断头取脑。 1 2 2 标本的采集及检测 在各时间点前1 5m i n 用过量水合氯醛麻醉大鼠后开 胸经左心室插管至主动脉( O 5m i n 内) ，依次灌注生理盐水 1 0 0m l 及4 4 多聚甲醛溶液2 5 0m 1 断头取脑固定于4 多聚甲醛溶

16、液中持续1 2 2 4h ，然后进行酒精脱水。二甲苯透 明浸蜡，包埋。 1 2 2 1 常规H E 染色切片常规脱蜡、水化。依次经苏木素染 色、1 盐酸酒精分化、返蓝以及伊红染色后进行脱水、透明、 封片。光镜下观察，胞质为红色，胞核为蓝色。 1 2 2 2T U N E L 染色以T U N E L 法检测凋亡细胞。切片常规 脱蜡、水化滴加脱氧核糖核酸转移酶( T D T ) 和地高辛标记的 d U T P 反应液。3 7 孵育1 2 0m i n ：滴加生物素化抗地高辛抗 体。3 7 孵育3 0m i n 后D A B 显色，苏木素复染，脱水、透明、 封片。 1 2 2 3N F K B p

17、 6 5 免疫组化染色用免疫组化S A B C 法检测 N F K B p 6 5 蛋白的表达。切片常规脱蜡、水化后行抗原热修 复，滴加5 0 斗l 兔抗鼠多克隆N F K B p 6 5 抗体( 1 ：2 0 0 ) ，4 过 夜；然后滴加生物素化山羊抗兔I 蜘，室温2 0m i n ；滴= | ：J U S A B C ， 室温2 0m i n 。D A B 显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。 1 3 统计学处理 在4 0 0 倍光镜下观察并随机选择血肿周围5 个不重复 视野计算阳性细胞积分光密度。所有数据以均数标准差 ( 元拯) 表示，采用S P S S1 3 0 软件进行数据分析，采

18、用t 检验 及P e a r s o n 相关分析P 0 0 5 表示差异有统汁学意义。 2 结果 2 1H E 染色 脑出血后6h 叮见轻度脑水肿血肿内红细胞形态完 整。1d 可见脑水肿明显，血肿周围可见中性粒细胞及淋巴细 胞浸润。胶质细胞开始增生。3d 时脑水肿最重，大量炎症细 胞浸润，胶质细胞增生明显，大量神经元变性坏死。7d 时血 肿有所吸收血肿周围组织疏松。胶质细胞及血管增生明显。 假手术组及对照组无明显病理改变。见图l 。 图1脑出血后不同时间点H E 染色I X 4 0 0 ) ( A 脑出血后6h ；B 脑出血后ld ；C 脑出血后3d ；D 脑出血后7d ) 论著 2 2T

19、U N E L 染色 T U N E L 染色阳性细胞是凋亡细胞，表现为核周染色质 浓缩的点状深染棕褐色细胞。凋亡细胞在脑出I l l L 后6h 出现， ld 明显增多，3d 达到高峰，此后逐渐减少，持续到7d ，与对 照组比较差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。凋亡细胞主要分布 在脑出血周围组织和同侧大脑皮层。假手术组仅见及少量凋 亡细胞。见表1 、图2 。 襄1脑出血后不同时间点T U N E L 阳性细胞表达 l 星垫，墼坌堂宣塞型巳! 驯百可J 世了厂丁 与对照组比较。P 0 0 5 ；与脑出血组6h 比较，恹O 0 5 图2 脑出血后不同时间点T U N E L 阳性细胞的表

20、达( X 4 0 0 ) ( A 脑出血后6h ：B 脑出血后1d ；C 脑出血后3d ；D 脑出血后7d ) 2 3N F - t c B p 6 5 免疫组化染色 脑出血周围组织N F K B p 6 5 阳性细胞于术后6h 开始 出现，1d 后逐渐增多。3d 达高峰，此后逐渐减少，持续到7d 仍高于对照组( P 0 0 5 ) 。阳性表达部位为胞核。主要表达于 神经细胞和少量胶质细胞。假手术组可见极少量阳性细胞。 见表2 、图3 。 表2 脑出血后N F K B p 6 5 蛋白表达( 妇墨。积分光密度H P ) 与对照组比较，P O 0 5 ；与脑出血组6h 比较，愀0 0 5 圈3

21、脑出血后不同时间点N F K B p 1 6 5 阳性细胞的表达( x 4 0 0 ) ( A 脑出血后6h ；B 脑出血后ld ；C 脑出血后3d ；D 脑出血后7d ) C H I N AM E D I C A LH E R A L D 中国医药弓掘19 万方数据 论著 2 4 脑出血后神经细胞凋亡与N F - K B p 6 5 表达的相关性分析 脑出血后T U N E L 表达与N F - - K B p 6 5 表达呈正相关( , - - 0 9 5 7 ， P 0 0 1 ) 。 3 讨论 凋亡即程序性死亡是在中枢神经系统涉及正常发育、再 生、增殖和病理变件的细胞死亡的主要方式哪。

22、已有研究发现， 在缺血性脑组织的不同部位町见到神经细胞凋亡阳。本实验结 果显示，凋亡细胞在脑出血后6h 出现，3d 达高峰，7d 时仍 有少量表达，提示脑出血后存在细胞凋亡且呈动态性变化， 据此推断细胞凋亡是脑出血周围组织损伤的一个重要标志。 N F K B 是一种广泛存在、功能多样的核转录因子，它在 免疫、炎症、细胞生长、分化、凋亡、癌变和个体发育等方面发 挥着多种重要的生物学功能1 7 1 。它由R e l A ( p 6 5 ) 和p 5 02 个亚 基以二聚体形式组成仅p 6 5 含有激活转录的处理区 s l 。已有 研究证实，脑出血早期即有N F - K B 表达参与脑出血周围组织

23、继发性损伤及脑水肿形成1 9 1 。刘兵荣等f - 0 1 也研究发现N F K B 与脑出血后腩水肿有关。本实验结果显示，N F K B p 6 5 免疫 组化阳性细胞于脑出J I I L 后6h 开始增多。1d 继续上升，3d 达高峰，此后逐渐下降，持续到7d 仍高于对照组，并且N F - K B 与T U N E L 阳性细胞的表达变化呈正相关，这与刘宗超等I “1 的 实验结果基本一致。大量研究证实，N F K B 具有促进中枢神 经系统神经细胞凋亡的作用，在创伤、脑缺血、阿尔茨海默 病及帕金森病的神经凋亡细胞内可以观察到N F K B 的激活 3 】。由此推断，N F K B 的激活

24、可能是导致脑出血后神经细胞 凋亡的一个重要原因。 综上所述脑出I L 后存在细胞凋亡且可能与N F K B 的 激活有关。进一步研究其具体机制将为脑出血的治疗提供新 的思维空间。 【参考文献1 【1 】陈吉相，季艳梅，孙吊刚，等依达托奉对脑出血大鼠细胞凋亡及N F - K B 2 0 1 0 年2 月第7 卷第5 期 表达的影响山东医药，2 0 0 7 , 4 7 ( 1 ) ：7 8 【2 】周向阳，吴家幂大鼠脑出血后血肿周围核因- K B 的表达和意义叨 皖南医学院学报，2 0 0 6 ，2 5 ( 1 ) ：1 5 - 1 7 【3 】董为伟神经保护的基础与l 临床【M 】北京：科学H

25、；版社，2 0 0 2 ：2 3 0 - 2 3 5 【4 】0 r r e n i u sS M i t o c h o n d n a lr e g u l a t i o no fa p o p t o t i ec e l ld e a t h J 1 T o x i c o l L e f t ，2 0 0 4 ，1 4 9 ( 1 ) ：1 9 - 2 3 【5 】N i w aM ，H a mA ，1 w a iT 。e t 旦1 C a s p a s ea c t i v a t i o na 8 a na p o p t o t i ce v i - d e n c ei

26、nt h eg e r b i lh i p p o c a m p a lC A lp y r a m i d a lc e l l sf o l l o w i n gt r a n s i e n t f o r e b r a i ni s c h e m i a 叨N e u r o s c iL e t t ，2 0 0 I ，3 0 0 ( 2 ) ：1 0 3 - 1 0 4 【6 】N a m u mS ，Z h uJ ，F i n kK ，e ta 1 A c t i v a t i o na n dc l e a v a g eo fc a s p a g e 一3i n

27、 a p o p t o s i si n d u c e db ye x p e r i m e n t a lc e r e b r a li s c h e m i a 棚JN e u r o , 1 9 9 8 ，1 8 ( 1 0 ) ：3 6 5 9 3 6 6 0 【7 】S i e b e n l i s tU ，F r a n z o s oG ，B r o w nK 。e ta 1 S t r u c t u r e ，r e g u l a t i o na n d f u n c t i o no fN F - k a p p aB 们JA a n uR e vC e

28、l lB i o l ，1 9 9 4 ，1 0 ( 2 ) ：4 0 5 - - 4 5 5 【8 】C h e nF E ，H u a n gD B ，C h e nY Q e ta 1 C r y s t a l s t r u c t u r eo fp S 0 p 6 5 h e t e r o d i m e r o f t r a n s c r i p t i o nf a c t o rN h Bb o u n dt oD N AmJN a t u r e , 1 9 9 8 ， 3 9 1 ( 2 2 ) ：4 1 0 - 4 1 3 【9 】A r o n o w s k

29、 iJ ，H a l lC E N e wh o r i z o n s f o r p r i m a r y i n t r a c e r e b r a l h e m o r r h a g et r e a t m e n t ：e x p e r i e n c ef r o mp r e c l i n i c a ls t u d i e s 册N e u r o lR e s ， 2 0 0 5 。2 7 ( 9 ) ：2 6 8 - 2 7 9 【1 0 】刘兵荣，丁新生，张勇，等大鼠脑出血后核因子一K B 的表达及黄茂多 糖的1 ：预作用阴中国神经免疫学和神经病学杂志，

30、2 1 ) 0 7 ，1 4 ( 2 ) ：1 6 0 1 6 3 【1 1 】刘宗超，饶明俐，周官恩实验忭脑出血中N F K B 的动态表达及其与 凋亡的关系【J 】巾风与神经疾病杂志，2 0 0 7 , 2 4 ( 3 ) ：2 8 8 2 9 0 【1 2 1 A o k iE ，Y a n o 咒Y o k o y a m aH ，e ta 1 R o l eo fn u c l e a rt r a n s c r i p t i o n f a c t o rk a p p aB ( N F - k a p p aB ) f o rM P T P ( 1 - m e t h y l

31、 - 4 - p h e n y l 一1 ，2 ，3 ，6 一 t e t r a h y r o p y r i d i n e ) - i n d u c e da p o p t o s i s i nn i s r a ln e u r o n so fm i c e J 1 E x p e r i m e n t a la n dM o l e c u l a rP a t h o l o g y ，2 0 0 9 ，8 6 ( 1o ) ：5 7 “ 【1 3 】P i z z iM ，S p a n oP D i s t i n c tr o l e s o fd i v e

32、r s en u c l e a rf a c t o r k a p p aB c o m p l e x e si nn e u r o p a t h o l o g i c a lm e c h a n i s m smE u rJP h a r m a c o l ，2 0 0 6 ， 5 4 5 ( 7 ) ：2 2 - 2 8 ( 收稿日期：2 0 0 9 1 2 2 1 ) ( 上接第1 5 页) 2 0 0 7 ，6 7 ( 7 ) ：7 4 8 - 7 5 6 【9 】H e r r m a n nM ，W i l d e m a n nB ，C l a e sL ，e t

33、a 1 E x p e r i m e n t a lh y p e r h o m o c y s t e i n e m i ar e d u c e sb o n eq u a l i t yi nr a t s 忉C l i nC h e m , 2 0 0 7 ( 5 3 ) ：1 4 5 5 1 4 6 1 【1 0 H e r r m a r mM ，T a m iA ，W i l d e m a n nB ，e ta 1 H y p e r h o m o e y s t e i n e m i ai n d u c e sat i s s u es p e c i f i c

34、a c c u m u l a t i o no fh o m o e y s t c i n ei nb o n eb yc a l l a - g e nb i n d i n ga n da d v e r s e l ya f f e c t sb o n e 【J 】B o n e ，2 0 0 9 , 4 4 ( 3 ) ：4 6 7 - - 4 7 5 【11 】K o hJ M ，L e eY S ，K i mY S ，e ta 1 H o m o c y s t e i n ee n h a n c e sb o n er e s o r p 一 ， 。 t i o nb y

35、s t i m u l a t i o no fo s t e o c l tf o r m a t i o na n da c t i v i t yt h m u s hi n c m a s e di n t r a c e l l u l a rR O Sg e n e r a t i o n 阴JB o n eM i n e rR e s 2 0 0 6 ，2 1 ( 7 ) ： 10 ( ) 3 1 0 1 1 【1 2 】S a k a m o t oW ，I s o m u r aH ，F u j i eKe ta 1 H o m o c y s t e i n ea t t

36、e n u a t e st h e e x p r e s s i o no fo s t e o c a l c i nb u te n h a n c e so s t e o p o n t i ni nM C 3 T 3 一E 1p r e - o s t e o b l a s t i ec e l l sI J B i o c h i mB i o p h y sA e t a ，2 0 0 5 ，1 7 4 0 ( 1 ) ：1 2 - 1 6 ( 收稿日期：2 0 0 9 埘- 2 2 ) 2 0 中国医药写报C H I N AM E D I C A LH E R A L D 、 _ 。， 万方数据