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1、研究原著文章编号： 1000-2790 （2006） 13-1173-03 抗血管内皮生长因子抗体对肝癌的放射增敏作用 郑青平， 陈龙华， 石玉生 （南方医科大学南方医院放疗科， 广东 广州 510515 = ） 收稿日期： 2005-10-09； 接受日期： 2005-11-15 作者简介： 郑青平. 博士， 主治医师. Tel：（020） 61365700 Email： zhengqp sina. com Radiosensibility of human hepatocellular carcinoma xenografts enhanced by anti- vascularendot
2、helialgrowthfactor monoclonal antibody ZHENG Qing-Ping，CHEN Long-Hua，SHI Yu-Sheng Department of Radiotherapy，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China 【Abstract】AIM：To investigate the inhibiting effects of com- bining anti-vascular endothelial growth factor （VEGF）monoclonal
3、 antibody（mAb）therapy with radiotherapy on the growth of hepa- tocellular carcinoma xenografts in vivo.METHODS：Human hepatocellular carcinoma cell line，SMMC-7721，was implanted sc in mice. The mice with xenografts were divided into 4 groups， radiation（RT）20 Gy group，RT 20 Gy plus mAb group，RT 30 Gy p
4、lus mAb group and control group.Anti-VEGF mAb was injected ip on alternate days for a total of 6 injections at a dosage of 50 g/ mouse. Single radiation doses were given 24 h after the 4th injection of mAb. Tumor diameters were measured and tumor volume was calculated. Mice were sacrificed 2 wk afte
5、r the 6th injection and the intra-tumoral microvessel density was determined by counting the stained vessels with immunohistochemistry. RESULTS：Radiation significantly reduced the growth and the microvessel density of tumors. The inhibitory effects were more significant when radiation was combined w
6、ith anti-VEGF mAb， and RT 30 Gy plus mAb was more effective than RT 20 Gy plus mAb. For RT 20 Gy group， RT 20 Gy plus mAb group and RT 30 Gy plus mAb group，the inhibitory rates of tumor weight were 75. 3%，83. 9% and 94. 7%，respectively. CONCLUSION： Anti-VEGF mAb enhances the radiosensibility of huma
7、n hepato- cellularcarcinomaxenografts. Thestrategyisoneofthe approaches for hepatocellular carcinoma treatment. 【Keywords】hepatocellular carcinoma；radiotherapy；anti-VEGF mAb；radiosensibility 【摘 要】目的：观察抗血管内皮生长因子抗体 （VEGF mAb） 与不同剂量放射联合对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用. 方 法：将 SMMC-7721 肝癌细胞种植于裸鼠皮下， 成瘤动物分为 单纯放射 20 Gy 组、
8、放射 20 Gy + 抗体组、 放射 30 Gy + 抗体组 和对照组， 腹腔给予抗 VEGF mAb 50 g/ 只， 隔日 1 次， 共 6 次， 放射剂量一次性给予. 测量肿瘤直径并计算瘤体积， 抗体 给药结束后 2 wk 处死动物， 免疫组化法测肿瘤微血管密度 （MVD） . 结果：放射能抑制肿瘤生长， 减少肿瘤 MVD， 放射与 抗体结合对肿瘤生长的抑制作用更显著， 且放射 30 Gy + 抗体 比放射 20 Gy + 抗体效果更好. 单纯放射 20 Gy 组、 放射 20 Gy + 抗体组和放射 30 Gy + 抗体组的瘤质量抑制率分别为 75. 3%， 83. 9% 和 94.
9、7%， 差异有统计学意义. 结论：抗 VEGF mAb 对放射治疗肝癌移植瘤有增敏作用， 是肝癌综合 治疗的有效途径之一. 【关键词】肝肿瘤； 放射疗法； 抗 VEGF 单抗； 放射增敏 【中图号】R73-36 【文献标识码】A 0 引言 放射治疗肿瘤的目的是尽可能提高肿瘤的放射 剂量以杀灭瘤细胞， 但同时正常组织和器官所受辐射 量也相应提高， 增加了放射治疗的副反应， 因而限制 了通过提高放射剂量来控制肿瘤的作用. 肝癌是放射 欠敏感肿瘤， 而正常肝组织对放射线较敏感. 单纯放 射治疗肝癌的疗效并不理想 1. 有报道2抗血管内 皮 生 长 因 子（ vascular endothelial
10、growthfactor， VEGF） 抗体可以抑制肝癌裸鼠移植瘤生长， 我们观 察抗 VEGF mAb 与不同放射剂量联合对肝癌移植瘤 生长的抑制作用， 以了解两者联合应用的机制与 方法. 1 材料和方法 1. 1 材料 Balb/ c-nu/ nu 小鼠 20 只 （南方医科大学 实验动物中心） ， 5 6 wk 龄， 雄性， 体质量 19. 0 22. 0 g，SPF 层流柜分笼饲养；SMMC-7721 人肝癌细 胞株 （武汉大学中国典型培养物保藏中心） ；Mono- clonal anti-VEGF antibody，produced in mouse，clone 26503. 11
11、（ Sigma 公 司） ； 培 养 箱（37， 50 mL/ L CO2） ， 倒置显微镜 （XDP-1， 上海光学仪器厂） ， Varian 23EX 医用直线加速器 （美国） ， RPMI-1640 细胞培养 液 （含 100 mL/ L 胎牛血清， 青霉素 1 105U/ g， 链霉 素 100 mg/ L） ， 胰蛋白酶， 免疫组化 SABC 法相关试 剂 （武汉博士德公司） . 1. 2 方法 3711 第四军医大学学报 （J Fourth Mil Med Univ） 2006； 27 （13） http： / / journal. fmmu. edu. cn 1. 2. 1 癌细
12、胞培养 SMMC-7721 人肝癌细胞株于 25 mL 培养瓶中繁殖传代， 细胞贴壁长满瓶壁后移入 250 mL 培养瓶继续传代繁殖， 取指数生长期细胞胰 酶消化， 2000 r/ min 离心 2 min， 收集细胞用生理盐水 悬浮， 显微镜下以细胞计数板计算细胞密度， 生理盐 水定容细胞密度为 2 1010/ L. 1. 2. 2 癌细胞种植 参考文献 3 方法， 裸鼠于饲 养环境适应 1 d 后种植癌细胞， 取裸鼠右后肢大腿外 侧皮下为种植点， 1 mL 注射器抽取 0. 2 mL 细胞悬液 （含 4 106个细胞） 注入种植点皮下. 1. 2. 3 动物分组及肿瘤生长观察 肿瘤种植后
13、1 wk，可观察到全部动物有明显皮下肿块形成， 第 10 日肿块直径约 5 mm. 将动物随机分为 4 组， 即单纯放 射 20 Gy 组、 放射 20 Gy + 抗体组、 放射 30 Gy + 抗体 组和对照组， 每组 5 只. 用游标卡尺测量肿块长径 （a） 及横径 （b） ， 隔日测量 1 次， 肿瘤体积 （V）= a b2/2. 1. 2. 4 抗体给予及放射治疗 以 0. 2 m 针式滤器 过滤除菌的 PBS 液溶解抗 VEGF mAb 至 100 mg/ L， 于肿瘤种植后 10 d 分组后腹腔注射抗 VEGF mAb， 50 g/ 只， 隔日 1 次， 共 6 次. 单纯放射组及
14、对照组同 样途径给予等体积量 PBS. 第 4 次给予抗 VEGF mAb 后的第 2 日行放射治疗， 放疗机房紫外线消毒， 受照 动物四肢以细绳固定在小木板上， 照射野大小 3 cm 3 cm， 源皮距 100 cm， 6 MeV 电子线， 剂量率 4 Gy/ min， 单纯放射组剂量 20 Gy， 放射 + 抗体组剂量 分别为 20 Gy 和 30 Gy， 全部放射剂量一次性给予. 1.2. 5 瘤体称质量 抗体给药结束后继续观察肿瘤 生长 2 wk， 于肿瘤种植后 34 d 处死动物， 仔细分离肿 块周边皮肤及非肿瘤组织， 瘤体称质量， 瘤质量抑制 率 （%）= （1 - 实验组平均瘤质
15、量/ 对照组平均瘤质 量）100. 1. 2. 6 免疫组化微血管密度 （MVD） 测定 将肿瘤 组织切成 3 mm 厚片状， 40 g/ L 甲醛固定 24 h， 脱水 石蜡包埋， 切片厚 5 m. 免疫组化 SABC 法： 一抗为 多克隆兔抗鼠 CD34 抗体， 工作浓度1:100 稀释. 即用 型 High-SABC 免疫组化试剂盒， 具体操作按试剂盒 说明进行， DAB 染色， 苏木素复染， 树胶封片. 选血管 内皮细胞染色密集区于高倍镜 （ 200） 下计数染色 细胞， 每片计数 5 个视野取平均值. 统计学处理 SPSS 10. 0 统计分析软件， 应用重复 测量数据方差分析处理肿
16、瘤体积变化数据， 多个独立 样本非参数检验处理瘤质量抑制数据和 MVD 数据， P 0. 05 为差异有统计学意义. 2 结果 2. 1 放射和抗 VEGF mAb 对肿瘤生长的抑制作用 SMMC-7721 人肝癌细胞培养时增殖及传代能力 强， 裸鼠皮下种植成瘤率高， 20 只动物全部成瘤. 种 瘤后 10 d 动物分组时各组肿瘤体积无显著性差异， 放射治疗前给予抗体 4 次， 肿瘤生长呈现减慢趋势， 但与非抗体组差异不显著. 放射治疗后， 单纯放射组 及放射 20 Gy + 抗体组肿瘤仍缓慢生长， 但放射 30 Gy + 抗体组肿瘤生长完全被抑制， 肿瘤缩小. 种瘤后 20 d 单纯放射组、
17、 放射 20 Gy + 抗体组和放射 30 Gy + 抗体组肿瘤体积显著小于对照组， 且放射与抗 体联合组优于单纯放射组， 此显著性差异一直持续至 动物处死 （种瘤后 34 d） ， 放射 30 Gy + 抗体组肿瘤体 积小于放射 20 Gy + 抗体组 （表 1） . 表 1 放射和抗 VEGF mAb 对肿瘤生长的抑制作用 （n =5，mm3，x s） 组别 种瘤后 （d） 10162034 单纯放射 20 Gy 44 18203 69378 1381704 703b 放射 20 Gy + 抗体 38 16139 20198 40490 118bc 放射 30 Gy + 抗体 41 141
18、39 31124 31119 80bce 对照47 17179 30526 797714 1792 bP 0. 01 vs 对照组；cP 0. 05 vs 单纯放射组；eP 0. 05 vs 放射 20 Gy + 抗体组. 2. 2 瘤质量抑制率和 MVD 单纯放射组、 放射 20 Gy + 抗体组和放射 30 Gy + 抗体组在动物处死时的 瘤质量抑制率分别为 75. 3%， 83. 9% 和 94. 7%， 均有 明显抑制肿瘤质量增长作用. 放射 30 Gy + 抗体组瘤 质量明显低于单纯放射组和放射 20 Gy + 抗体组. 各 处理组 MVD 低于对照组， 放射与抗体联合较单纯放 射组
19、 MVD 低， MVD 在放射 20 Gy + 抗体组与放射 30 Gy + 抗体组之间差异无统计学意义 （表 2） . 表 2 瘤质量抑制率与微血管密度（n =5，x s） 组别瘤质量 （g） 瘤质量抑 制率 （%） MVD 单纯放射 20 Gy1. 78 0. 48b75. 321. 4 5. 4b 放射 20 Gy + 抗体1. 16 0. 18b83. 98. 6 2. 1bc 放射 30 Gy + 抗体0. 38 0. 02bce94. 77. 6 1. 5bc 对照7. 22 0. 6142. 6 6. 1 bP 0. 001 vs 对照组；cP 0. 05 vs 单纯放射组；eP
20、 0. 05 vs 放射 20 Gy + 抗体组. 4711 第四军医大学学报 （J Fourth Mil Med Univ） 2006； 27 （13） http： / / journal. fmmu. edu. cn 3 讨论 SMMC-7721 肝癌裸鼠移植瘤细胞的形态和结构 与人肝癌细胞特性类似 3， 移植瘤生长迅速， 未经治 疗的肿瘤生长速度快， 单纯放射治疗能延缓其生长速 度， 联合抗 VEGF mAb 后抑制肿瘤生长效果更明显， 但单纯放射或放射 20 Gy 加抗体组肿瘤仍呈逐渐加 速的生长趋势. 虽然放射和抗 VEGF mAb 均能抑制 肝癌移植瘤生长， 但实验结果显示放射 3
21、0 Gy 加抗体 是较好的联用方式， 瘤体生长停滞并有缩小， 对瘤质 量和瘤体积的抑制都优于低剂量放射组. 放射是以肿瘤细胞为靶点的治疗措施， 通过对肿 瘤细胞的杀灭来控制其生长. 放射在杀灭瘤细胞的同 时又诱导肿瘤细胞表达 VEGF 升高， 保护血管内皮细 胞抗拒放射线攻击， 促进肿瘤血管形成 4； 或通过提 高肿瘤细胞基质分解酶活性， 增强瘤细胞的侵袭 力 5， 因而放射诱导了肿瘤的保护机制， 降低瘤细胞 对放射线的敏感性. 抗 VEGF mAb 抑制 VEGF 的表达 和血管形成， 使肿瘤赖以生长及转移的血管形成不 足， 本身具有抗肿瘤作用； 又能通过降低 VEGF 表达 使血管内皮细胞
22、失去免受放射线攻击的保护， 增强瘤 细胞的放射敏感性， 因而抗 VEGF mAb 与放射起到 了协同抑瘤作用 6， 此协同作用并不是各自作用的 简单合并， 而是起到了效应的放大. 研究表明 7， 抗 VEGF mAb 的抑瘤作用是暂时 的， 停止抗体后肿瘤又会恢复原来的生长活性. 因而 抗 VEGF mAb 须与具有细胞毒作用的治疗措施联合 才能起到协同作用 8. 抗 VEGF mAb 放射增敏的机 制可能比较复杂， Winkler 等 9发现， 抗 VEGF mAb 能诱导肿瘤血管出现一个 “血管正常化的窗口期” ， 在此期间内， 肿瘤血管与正常血管功能相似， 肿瘤氧 水平高， 提高了肿瘤细
23、胞对放射的敏感性， 因此在窗 口期内给予放射才能起到协同抗肿瘤作用.“血管正 常化窗口期” 出现在抗体治疗的1 wk 左右， 我们也选 择这一时期给予放射治疗， 收到了预期的结果. 血管形成是一个复杂的过程， 有多种生长因子参 与其中； 放射治疗又涉及时间剂量分割方式的不同， 我们的实验结果只是其中可行性组合之一. 放射与抗 VEGF mAb 联合治疗肝癌取得了较好的实验效果， 是 肝癌综合治疗方法的一条新思路. 【参考文献】 1殷蔚伯， 谷铣之. 肿瘤放射治疗学 M . 3 版. 北京： 中国协和医 科大学出版社， 2002： 783 -784. 2解乃昌， 李国威， 王志亮， 等. 抗血管
24、内皮生长因子抗体对实验 性肝癌的生长抑制作用 J . 中国普外基础与临床杂志，2002， 9 （4） ： 242 -245. 3郑 红， 王 琳， 李静芳. 裸鼠皮下人肝癌移植瘤模型的建立 J . 昆明医学院学报， 2003， 24 （3） ： 39 -41. 4Abdollahi A， Lipson KE，Han X， et al. Su5416 and su6668 attenu- ate the angiogenic effects of radiation-induced tumor cell growth fac- tor production and amplify the dir
25、ect anti-endothelial action of radia- tion in vitro J . Cancer Res， 2003， 63 （13） ： 3755 -3763. 5Kaliski A， Lassau N， Maggiorella L， et al. Antiangiogenic effect and tumor growth control achieved by an MMP-inhibitor combined to ra- diation in vivo，targeting radio-induced MMP-2 enhancement and VEGF m
26、odulation J .Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004， 60 （Suppl） ： 368 -369. 6Damiano V，Melisi D，Bianco C，et al. Cooperative antitumor effect of multitargeted kinase inhibitor ZD6476 and ionizing radiation in glioblastoma J . Clin Cancer Res， 2005， 11 （15） ： 5639 -5644. 7单 岩， 张 谦， 吴国华. 抗血管内皮生长因子抗体对小鼠肾母 细胞
27、瘤生长和转移的抑制 J . 第四军医大学学报，2004， 25 （16） ： 1534 -1535. 8Steiner HH，Karcher S，Mueller MM，et al. Autocrine pathways of the vascular endothelial growth factor （VEGF）in glioblastoma multi- forme：Clinical relevance of radiation-induced increase of VEGF lev- els J . J Neurooncol， 2003， 66 （1-2） ： 129 -138. 9W
28、inkler F， Kozin SV， Tong RT，et al. Kinetics of vascular normali- zation by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radia- tion：Role of oxygenation， angiopoietin-1， and matrix metalloprotein- ases J . Cancer Cell， 2004， 6 （12） ： 553 -563. 编辑 王 睿 5711 第四军医大学学报 （J Fourth Mil Med Univ） 2006； 27 （13） http： / / journal. fmmu. edu. cn