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1、论著 文章编号： 1000-5404 （2006） 16-1704-03 异丙酚对大鼠中枢神经核团一氧化氮合酶表达的影响 文欣荣1， 陶国才1， 范晓棠2， 张金海2， 胡 荣2 （第三军医大学： 1西南医院麻醉科；2基础医学部神经生物学教研室， 重庆 市神经科学研究所， 重庆 400038） 提 要：目的 通过检测异丙酚静脉全麻诱导大鼠中枢一氧化氮合酶 （nitric oxide synthase，NOS） 的表达， 探讨异丙 酚的可能中枢作用位点。方法 采用 NADPH-d 酶组织化学法检测大鼠脑片的 NOS 阳性神经元在神经核团的分布。结果 异丙酚作用的大鼠伏核、 外侧隔核、 下丘脑室旁
2、核、 膝状体腹下核、 背外侧膝状核、 视上核、 视交叉上核、 视前腹侧核、 弧 束核、 杏仁基底外侧核、 丘脑室旁核、 外侧缰核、 海马回嗅觉小岛及乳头状核等核团 NOS 阳性神经元的表达明显减少， 与对 照组比较均非常显著差异 （P 0. 01） 。结论 异丙酚在大鼠中枢神经系统的作用部位与神经核团有关。 关键词：异丙酚； 中枢神经系统；一氧化氮合酶 中图法分类号：R338. 2； R614. 1； R971. 2文献标识码：A Nucleus distribution of nitric oxide synthase in central nervous system in rat aft
3、er anesthetization with propofol WEN Xin-rong1，TAO Guo-cai1， FAN Xiao-tang2，ZHANG Jin-hai2，HU Rong2（1Department of Anesthesiology，Southwest Hospital， 2Department of Neurobiology，College of Medicine，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China） Abstract：Objective To clarify the effective
4、location of propofol in central nervous system（CNS） . Methods Forty-two Wistar rats were ramdomized into control group， 50 mg/ kg propofol， 100 mg/ kg propofol， 150 mg/ kg propofol，tail shearing，propofol followed by tail shearing（n =7 in each group） . The NOS expres- sions in the CNS were recorded b
5、y NADPH-d histochemistry after anesthesia by intraperitoneal injection of propofol. ResuIts Rather widely stained NOS positive neurons were observed in the control group. In propofol groups，the NOS expressions were decreased significantly as compared with the control group，mainly located in ACB，LS，P
6、e，VLG，Den，SO，SCh，AVPO，Sol，SuM，BL，PV，LHb and Icj，showing a negative dose- effect relation with propofol. ConcIusion Propofol has the determined sites of action in CNS and the decrease of NO synthesis by the inhibition of NOS may play a role in propofol-induced general anesthesia. Key words：propofol；c
7、entral nervous system；nitric oxide synthase 静脉全身麻醉药异丙酚在中枢神经系统的作用部 位至今仍不清楚。一氧化氮 （nitric oxide，NO） 是一种 可逆性弥散的神经介质或信使物质， 一氧化氮合酶 （nitric oxide synthase，NOS） 是合成 NO 的关键酶， 研 究 NOS 阳性神经元在脑内的分布， 可为认识大脑功能 变化提供形态学依据 1。本研究应用 NADPH-d 酶组 织化学法检测 NOS， 研究异丙酚静脉麻醉在大鼠中枢 神经系统的可能作用部位， 旨在为进一步探讨异丙酚 静脉全身麻醉机制提供形态学定位依据。 作者简介
8、： 文欣荣 （1973 - ） ， 男， 四川省广安市人， 硕士， 主治医师， 主要从事 静脉全麻药物作用与基因表达方面的研究。电话：（023） 68754200 通讯作者： 陶国才， 电话：（023） 68754197 收稿日期： 2006-03-01； 修回日期： 2006-05-15 1 材料与方法 1. 1 药品与试剂 异丙酚纯品由美国阿斯利康公司提供， 还原型 NBT 及 NADPH 均为德国 Boehringer Mannheim Corp（Roche） 公司产 品， Olympus 显微镜。 1. 2 动物模型 Wistar 大鼠 42 只 （第三军医大学实验动物中心提供） ，
9、体 质量约 150 g， 雌雄不拘， 随机分为空白对照组 （C 组， 7 只） 、 小 剂量异丙酚组 （50 mg/ kg， P1组， 7 只） 、 中等剂量异丙酚组 （100 mg/ kg， P2组， 7 只） 、 大剂量异丙酚组 （150 mg/ kg， P3组， 7 只） 、 断尾刺激组 （S1组， 7 只） 、 异丙酚作用后断尾刺激组 （S2 组， 7 只） 。将各组大鼠腹腔内注射相应剂量异丙酚后， 麻醉1 h。 C 组为腹腔注射等量生理盐水，P1组腹腔注射异丙酚50 mg/ kg， 4071 第 28 卷第 16 期 2006 年 8 月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACTA A
10、CADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Vol. 28，No. 16 Agu. 2006 第 16 期 文欣荣， 等. 异丙酚对大鼠中枢神经核团一氧化氮合酶表达的影响 P2组腹腔注射异丙酚100 mg/ kg， P3组腹腔注射异丙酚 150 mg/ kg， S1组腹腔注射等量生理盐水， S2组腹腔注 射异丙酚 100 mg/ kg。S1、S2组大鼠在腹腔注射药物 后， 立即剪断其尾， 并用止血钳钳夹鼠尾近心断端防止 出血。断尾处理 1 h。 1. 3 NADPH-d 酶组织化学法 各组动物分别于 1 h 后在 1% 戊巴比妥钠 100 mg/ kg 腹腔 注射
11、麻醉下， 立即用手术器械开胸， 右心房开窗， 经左室灌注生 理盐水 300 ml 后， 再灌注 4% 多聚甲醛 （0. 1 mol/ L，PB，pH 7. 4） 300 ml， 然后取全脑置于 30% 蔗糖 （4% 多聚甲醛） 液中后 固定， 4过夜， 冠状冰冻切片， 片厚 35 m， 连续切片， 隔 5 取 1， 用0. 01 mol/ L PBS 漂洗3 次， 入含0 3%Triton 的 PBS 液中30 min， 然后将切片放入 NADPH-d 染色液 （0. 1 mol/ L PB 配制， pH 7. 3 ， 含 0. 1% 还原型 NADPH、0. 01% NBT 和 0. 03%
12、 Triton-X 100） ， 37 孵育 40 60 min。明胶贴片， 晾干后经上行梯度乙 醇脱水， 二甲苯透明， D. P. X 封片。 1. 4 统计学方法 实验数据以 -x s 表示， 采用 SPSS 10. 0 软件进行组间比较 配对双尾 t 检验。 2 结果 用 NADPH-d 组织化学方法研究发现 NOS 阳性反应呈蓝 色， 阳性产物集中于细胞质和突起部分， 细胞核不着色。神经 元胞体形态多样化， 呈梭形、 三角形、 圆形等多种形状， 突起有 一个或多个。神经核团的 NOS 阳性神经元以每个核团内的数 目来表示 （表 1， 图 1、 2） 。 表 1 NOS 在大鼠中枢神经核
13、团的表达 神经核团CP1P2P3S1、S2 伏核9. 9 3. 66. 3 2. 6a4. 2 1. 6ac1. 5 0. 7ac9. 4 3. 04. 5 1. 2a 乳头状核10. 1 4. 67. 6 1. 2a5. 5 1. 3ac2. 5 0. 6ac9. 9 2. 65. 2 1. 6a 视交叉上核16. 5 4. 46. 5 2. 4a3. 2 0. 8ac1. 4 0. 3ac14. 5 5. 43. 1 0. 5a 视前腹侧核10. 3 4. 67. 3 0. 6a5. 6 0. 7ac2. 6 0. 3ac12. 3 4. 67. 7 2. 8a 弧束核7. 5 2. 35
14、. 5 1. 3a3. 9 1. 2ac1. 8 0. 4ac8. 5 3. 33. 0 1. 1a 背外侧膝状核11. 7 5. 86. 7 2. 8a4. 1 1. 4ac2. 2 0. 5ac10. 8 3. 86. 2 1. 9a 膝状体腹下核9. 6 3. 27. 0 2. 2a4. 8 1. 5ac1. 7 0. 5ac10. 6 3. 25. 2 1. 4a 下丘脑室旁核11. 4 3. 28. 8 3. 2a5. 4 2. 1ac2. 2 0. 4ac12. 0 4. 23. 9 1. 6a 视上核18. 3 1. 95. 7 1. 8a3. 4 1. 4ac1. 7 0. 6
15、ac17. 6 3. 63. 7 1. 0a 外侧隔核15. 3 5. 26. 5 2. 6a4. 1 1. 6ac2. 8 0. 6ac17. 5 5. 62. 8 0. 6a 外侧缰核10. 4 2. 47. 5 2. 3a5. 1 1. 3ac2. 3 0. 6ac15. 4 7. 7b15. 3 7. 9b 海马回嗅觉小岛13. 8 5. 06. 6 2. 5a3. 3 1. 2ac1. 6 0. 7ac19. 4 6. 3b17. 5 5. 6b 丘脑室旁核7. 8 2. 24. 3 1. 2a2. 7 0. 5ac1. 5 0. 3ac17. 7 5. 5b18. 2 4. 2b
16、杏仁基底外侧核13. 5 3. 97. 4 2. 9a4. 6 1. 5ac2. 2 0. 4ac25. 3 8. 4b27. 6 6. 6b a：P 0. 01， 与 c 组比较；b：P 0. 01， 与 P1、 P2、 P3 组比较；c：P 0. 01， 与 P1、 P2 组比较 图 1 P1 组 NOS 在外侧隔核的表达 （酶组织化学 100） 图 2 P2 组 NOS 在视上核的表达 （酶组织化学 100） 在 C 组大鼠脑内 NOS 阳性神经元分布相当广泛， 几乎涉 及所有区域： 包括伏核 （accumbens nucleus，ACB） 、 外侧隔核 （lateral septal
17、nucleus，LS） 、 下丘脑室旁核 （periventericular hy- pothealamic nucleus，Pe） 、 膝状体腹下核 （ventral lateral genicu- lalaten nucleus，VLG） 、 背外侧膝状核 （dorsal endapiriform nucle- us，Den） 、 视上核 （supraotic nucleus， SO） 、 视交叉上核 （suprachi- asmatic nucleus，SCh） 、 视前腹侧核 （anteroventral preoptic nucle- us， AVPO） 、 弧束核 （nucleus
18、 of the solitary tract，Sol） 、 杏仁基底 外侧核 （basolateral amygdaloid nucleus，BL） 、 丘脑室旁核 （para- ventricular thalamic nucleus，PV） 、 外侧缰核 （lateral habenular nucleus，LHb） 、 海马回嗅觉小岛 （islands of Calleja， Icj） 及乳头 状核 （supramammillary nucleus，SuM） 等核团， 延髓分布较少。 P1、 P2、 P3组大鼠中枢 NOS 阳性神经元较 C 组明显减少， 在 ACB、 LS、 Pe、 V
19、LG、 DEn、 SO、 SCh、 AVPO、 Sol、 SuM、 BL、 PV、 LHb 及 Icj 等核团， P1、 P2、 P3组 NOS 阳性神经元的表达分别与 C 组 比较均有非常显著差异 （P 0. 01） ， 且 NOS 阳性神经元表达与 异丙酚剂量负相关， P3与 P1、 P2比较有非常显著差异 （P 0. 01） ， P2与 P1比较有非常显著差异 （P 0. 01） 。提示异丙酚 抑制 ACB、 LS、 Pe、 VLG、 DEn、 SO、 SCh、 AVPO、 Sol、 SuM、 BL、 PV、 LHb 及 Icj 等核团内的 NOS。 S1组大鼠脑内 NOS 阳性神经元分
20、布相当广泛， 几乎涉及所 5071 有区域， 与 C 组比较在 BL、 PV、 LHb 及 Icj 等核团 NOS 阳性神 经元表达明显增多， 有非常显著差异 （P 0. 01） ， 提示断尾刺激 可能使 BL、 PV、 LHb 及 Icj 等核团内 NOS 增多。S2组大鼠中枢 ACB、 LS、 Pe、 VLG、 DEn、 SO、 SCh、 AVPO、 Sol 及 SuM 等核团 NOS 阳性神经元表达明显减少， 分别与 C 组、 S1组比较有非常显著 差异 （P 0. 01） ， 提示 S2组大鼠中枢上述核团内 NOS 可能受到 异丙酚抑制。但在 BL、 PV、 LHb 及 Icj 等核团
21、 S2组 NOS 阳性神 经元表达较 P1、 P2、 P3组明显增多， 有非常显著差异 （P 0. 01） ， 提示 BL、 PV、 LHb 及 Icj 可能参与大鼠中枢对断尾刺激 的反应而引起 NOS 增多。 3 讨论 全身麻醉中枢作用部位的研究表明， 突触有可能 是神经组织结构上全麻作用的位点， 但并非是大体解 剖上的作用部位。徐礼鲜等 2通过检测 FOS 蛋白及 NOS 的表达来研究吸入麻醉药物甲氧氟烷大鼠中枢 作用位点， 但在其研究的实验动物分组方面， 未设置疼 痛刺激组排除疼痛等刺激诱导的 NOS 表达对研究麻 醉作用位点的影响； 并且甲氧氟烷和硫喷妥钠等麻醉 药刺激性较强， 异丙酚
22、可以使机体处于无意识状态而 无其他特殊效应 3， 比较适合于全麻机制的研究。 NO 是生物体内在 NOS 作用下，以 L-精氨酸及分 子氧为底物合成的一种结构简单的双原子自由基， 可 作为第二信使或细胞功能调节因子而参与体内一系列 生理和病理条件下的生物过程， 调节循环、 神经、 免疫 等系统一系列的生理与病理活动， 生物机体内的 NOS 至少发现有 3 种类型： 神经型、 内皮型、 诱导型， 前两者 又总称为构成型， 其活性依赖于 Ca2 +/ CaM 的调节， 作 用迅速而短暂 4。NADPH-d 组化法是用 NADPH 和 氯化硝基四氮唑蓝 （nitroblue tetrazoline
23、chloride， NBT） 与固定后的脑切片一起孵育， NADPH-d 阳性神经元可 把 NBT 还原为不可溶的深蓝色 formazan 反应产物 5。 NADPH-d 酶组织化学技术将中枢神经系统形态定位 与细胞功能活动结合起来 用 NADPH-d 组织化学方法研究表明 C 组 NOS 阳 性神经元在大鼠脑内的分布相当广泛， 几乎涉及所有 区域， 阳性神经元大多呈多角形、 梭形； 还有一些呈圆 形和卵圆形等， 而且突起染色都很清晰。这一结果提 示 NO 在大鼠脑内参与多种生理活动。尽管目前对 NO 的作用及作用机制的认识还不完全清楚， 但大量 的研究表明， NO 是一种特殊的神经活性物质，
24、 其作用 是多方面的。它不仅参与突触传递过程， 而且还可以 充当第二信使， 具有介导兴奋性氨基酸的作用 6。P 1、 P2、 P3组 NOS 在 ACB、 LS、 Pe、 VLG、 DEn、 SO、 SCh、 AV- PO、 Sol、 BL、 PV、 LHb、 Icj 及 SuM 核团表达急剧减少， 且与异丙酚的剂量负相关， 由此表明异丙酚麻醉作用 机制与抑制 NOS 活性， 使 NO 释放减少， 从而发挥麻 醉作用有关， 同时支持这些部位可能为异丙酚的全身 麻醉作用位点。S1、 S2组 NOS 在 PV、 LHb、 Icj 及 SuM 等核团表达显著增多， 表明 NO 可能在大鼠中枢的上 述
25、核团内的不同水平发挥痛觉调控作用 7。 在研究方法上， 由于 NOS 表达对于不同刺激选择 性差， 易受其他非实验因素的干扰， 如光线、 气味和应 激的反应等， 因此除了要严格控制合适的实验条件外， 对于如何排除无关因素的干扰以求得结果的正确性是 至关重要的。本实验采取以下措施： 大鼠于实验前 放置在安静、 温暖和避强光的饲养环境内 24 h 以上； 在实验操作时力求轻柔， 尽量保持基础状态的稳定； 设置严格的对照组， 除麻醉因素外其他条件相同， 并 设置异丙酚作用后断尾刺激组， 排除麻醉因素外的刺 激对异丙酚静脉全麻中 NOS 表达的影响； 异丙酚作 用后注意维持大鼠呼吸、 循环稳定。 综上
26、所述， 通过检测异丙酚刺激大鼠中枢神经系 统 NOS 的表达， 表明在中枢神经系统内有与异丙酚静 脉全身麻醉功能相关的神经核团存在， 推测异丙酚麻 醉作用与抑制 NOS 活性、 减少 NO 生成有关。而异丙 酚静脉全身麻醉的具体机制， 值得进一步探讨。 参考文献： 1MILNE B，HALL S R，SULLIVAN M E，et al. The release of spinal prostaglandin E2 and the effect of nitric oxide synthetase inhibition dur- ing strychnine - induced allodyn
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