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1、，1 3 2 2 中国药 理学 通报 ch ， 尸 户 . 叔 赶J g 让 创B “ 2 花 左 in Z oc7 oc认 23( 1 0): 1 3 2 2 5 复智散对阿尔采末病模型小鼠治疗作用的研究 李绪领 ， 王德 生， ， 孙曼尹 ， 赵 宝全 2 ， 汤 颖 ， ， 张 婷 2 ， 曲 恒燕 2 . 李 前2 ( 1 . 哈尔滨医 科大学第一临 床医 学院神经内 科， 黑龙江哈尔滨巧 1 1 ; 2 ， 军事医学 科学院毒物药物研究所， 北京 1 008 50) 中 国图书分类号: R 刁 3 2 ; R2 8 2 . 7 1 ; R3 2 2 . 5 1 ; R3 2 9 .
2、料; R745 . 7 05. 3 1 ; R9 7 76 文献标识码: A 文章编号: 1 阅1 一 1 9 7 8 ( 2 叨， ) 1 0 一 1 3 2 2 一 以 摘要: 目 的 观察复 智散( 以5)对A p 二 _ 。 诱导的阿尔采 末 病 ( 人 D ) 模型 小鼠 的 治疗作用。 方法 A p 乃 _ 。 侧脑室 注射制 作 A D 小鼠 模型 以不同剂量的F Z S 灌胃 治 疗， 通过M o m . 水迷 宫和小鼠穿梭程序自 动控制仪检测小鼠的 认知功能， 采用比 色法测定小鼠 脑内胆碱乙酸基转移酶( C h A T ) 、 乙酞胆碱酌 酶( A C h E ) 活性及乙
3、酞胆碱( A C h)含量。结果不同剂量的 FzS 不仅对A D 小鼠的 认知功能有明显的改善作用， 且能增 加A D 小鼠 脑内的ChA T 活性及A Ch 含量 并降低A ChE 活 性。 结论 r 签在1 . 25 109 纯一 ， 剂量范围内均有治疗 小鼠A D 的 作用， 但用1 . 乃9 k g 一 ， 剂量时治 疗效果最佳。 关键词: 复智散; 阿尔采末病; 胆碱乙酸基转移酶; 乙酸胆碱 酷酶; 乙酞胆碱; 认知功能 阿尔采末病( A D ) 是一种进行性神经系统变性 疾病， 约占 所有痴呆病例的50%。 65岁以 上的老年 人中， A D的患病率为5 %， 而80岁以上的老年人
4、 中， A D的患病率可达到20%， 且到2050年A D的患 病率 将是现 今的3 倍 。随 着 人 类寿 命的 延长和世 界人口的快速老龄化， A D的破坏性正日趋明显。 无论在发达国家或发展中国家， A D 将成为本世纪 危害 公众健康的主要原因。然而， 目 前临床用于治 疗A D的药物， 仍以 对于早、 中 期A D 有效的对症治 疗为主， A D的防治已 成为医药工作者们迫切需要 攻克的难题。复智散( FzS)是一个传统的中药复 方， 已有临床及实验室研究证明FzS 治疗 A D有 效卜， J 。 本研 究 应 用A p 。 _ 3 5 侧 脑 室注 射 制 作出A D 小鼠 模型，
5、 旨 在观察不同剂量的咫5 对认知功能及 收稿日 期二 2 创 刀一 04一 18， 修回日 期二 2 1】 片一 07一 05 基金资助: 国家自 然科学基金资助项目( N o 3 伪7 072 6); 黑龙江省自 然科学基金重大项目 资助课题( N o 2 到0 3 一 5) 作者简介: 李绪领( 1 975 一 )男， 博士， 主治医师 研究方向: 痴呆. 脑 血管 病， 1 : 0 1 0 劫8 7 4 创 ， ， E 一 二1 ; h y d l 妞 ul i n g 1 6 3 c o m ; 王德生(l9 叨一 ) ， 男， 教授， 博士生导师， 研究方向: 痴呆， 脑血管病，
6、通讯作者， Tel : 例5 1 .5 3 阅3 6 16 E 币 阳 目 : h y d 明 d s h 。 加 l a il . c O m; 孙曼界( 1 如1 一 ) ， 男， 教授 研究方向: 生化药理学， 通讯 作 者， Tel:01 。 伪93 肠 91， E 二心: . 咧 川 腼 ， 朋 cn 脑内胆碱能系统的影响。 1 材料与方法 1 . 1 材料 11 . 1 动物昆明小鼠， ?占 各半， 体重( 22士 2) 9 ， 由 北京军事医学科学院动物中心提供。自由食 水， 每天照明时间12h ， 室温( 23士 1)。 1 . 1 . 2 制剂 F z S 由 人参、 黄芬、
7、 节营蒲等8 味中 药组成， 该复方中全部中药均购自 哈尔滨市药材公 司。 按比 例混合， 加水浸泡4Dm in ， 煎煮l h ， 滤出 药 汁， 加水继续煎煮4 0m in后过滤， 将两次滤出的药 汁混合， 配成。 . 259 生药， m l 一 的FZs 水提液， 4 保存。 实验中给药剂量以 水提液中 所含生药的量计 算。 1 . 1 . 3 主要试剂 A p 二 _ 。 ( Si gma 公司) ， C h AT 检 测试剂盒( 南京建成生物工程研究所， 批号: 2 0050 721 ) ， A ChE 检测试剂盒( 南京建成生物工程 研究所， 批号; 2 加5 0 7 25) ，
8、毒扁豆碱( A LEx ls公 司) ， 氯化轻胺( 北化公司) 。 1 . 1 ， 4 主要仪器紫外可见分光光度计: U V 一 50 型， 日 本岛津公司产品; 高速冷冻离心机: 20P R 石 型， 日 本日 立公司; 恒温水浴箱: D K 名 A x型， 上海; M o m s 水迷宫自 动控制仪装置: 中国医学科学院药 物研究所研制; x C sZ小鼠自 动穿梭控制仪: 中国医 学科学院药物研究所研制。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 实验动物的筛选 正式实验前， 对小鼠 进行 连续4 d 的水迷宫训练， 每天训练两次， d s 对小鼠 进行M 。 币 ， 水 迷宫 及自 动穿
9、 梭控制仪 检测。 潜伏 期 大于30。 或ro次循环的电击时间超过2 0 。 的小鼠 为先天愚钝鼠 被淘汰， 正常小鼠 用于实验。 1 . 2 . 2 动物模型的制备 将A p 二 _ 、 溶于无菌生理 盐水中 ， 浓度 为1 9 ， L 一 。 密封 后于37 培 养 箱内 孵育% h ， 使之成为凝聚态， 参照M au rie。 的方法进 行 小鼠 侧 脑 室内人 日 注 射121， 注 射 剂量 为 每 只 小鼠 4 闪， 假 手术组注射 相同体 积的生理盐水。 注射lld 后对A p 注射小鼠 进行M o rti s 水迷宫及自 动穿梭控 制仪检测， 水迷宫实验潜伏期大于9 0 :
10、或自 动穿梭 实验ro次循环中的累计电击时间超过20 。 的小 鼠， 为造模成功小鼠。 将造模成功的小鼠 用于实验。 万方数据 中国 药理学通报ch。尸 产赶心 确。 “ 以 明众 以场陇 名 认 Z J洲 7 oct ; 23( 1 0) ，1 3 2 3 1 ， 2 . 3 动物分组及给药方法动物被随机分为正 常对照 组、 假手术组、 模型组、 低剂量组(1. 25 9 k g 一 ， ) 、 中 剂 量 组( 2 . 5 9 k g 一 ) 、 高 剂量 组(5。 9 k g 一 ， ) 、 超高 剂 量 组( 109 ， 吨一 ， ) 。 每组8 只 小鼠 。 A p 注射d lZ开始
11、给药， 连续灌胃Zl d 。 1 . 2 . 4 行为学 检刚通过M o m ， 水迷宫实验中 记 录潜伏期的长短测定小鼠的空间辨别能力， 设定搜 索时间为1 20 ， ， 1 加 。 内找不到平台者按1 20 。 计 时。自 动穿梭实验， 以控制仪记录的电击时间测定 小鼠的 学习、 记忆能力， 仪器设定循环10次， 间隔3 。 ， 每次嗡鸣时间3 。 ， 电击时间4 。 ， 记录总的电 击时 间。 1 ， 2 . 5 小鼠脑内A C h含量及 C h A T 、 A C h E活性检 测 断头处死小鼠， 于冰台 上取出 脑组织， 剔除小脑 及脑干。 用冰冷的生理盐水冲净表面血迹， 滤纸拭 干
12、， 后以电子天平称重。在冰盒内使用玻璃匀浆器 制备成10%( 1 : 9 ， W/V)的 脑组织匀浆， 在4 离心 ( 4 000r ， m i n 一 ， x l o m i n ) ， 取 一 清 液 进 行 实 验 。 按 C h A T 及A C h E 试剂盒说明书测定C h A T 及A C h E 活 性。 ChAT 活性测定原理: 乙酞辅酶A与胆碱做底 物， 二者在乙酞胆碱转移酶的 作用下反应， 生成乙酞 胆碱和辅酶A ， 辅酶A 与显色 物质反应， 以吸光度计 算c h A T 活 力( 单位: Iu 9 一 ) 。 A c h E 活性测定原 理: 乙酞胆碱醋酶水解乙酞胆碱
13、生成乙酸和胆碱， 胆 碱与羚基显色剂反应生成T N B ( 对称三硝基苯) 黄 色化合物， 根据颜色深浅进行比色定量， 水解产物胆 碱的数量可以反应胆碱脂酶活性( 单位; u 二 9 一 P r o ) 。 考马斯亮兰法测定蛋白 含量。 用碱性轻胺比 色法测定A C h 含量， 即取脑组织匀浆0 . s m l 加1 . 4 d蒸馏 水混合， 加1 . 5 m lll( 11 . L 一 ， 毒扁豆 碱。 ， Z ml， 缓慢加人1 . 84m m ol L 一 ， 三氯乙酸0 . 8 耐充分混 合， 离心( 5 0 00 ! m l n 一 ， x sm i n ) 后取上清液1 . 0 记
14、， 加人碱性轻胺( 3 ， 5J l l o 1 L 一 氢氧化钠与2 . 0 mol L 一 氯化经 胺等体积混合而成) 1 . O ml， 室温放 置巧m in后， 依次加人4 m ol L 一 盐酸、 0 . 37m ol L 一 三氯化铁各。 . 5耐。充分混匀， 在4 92 n m处比 色， 计算A c h 含量m m ol 9 一 蛋白 。 标准管以02 IYuno l L 一 的A c h 代替 脑 组 织 匀 浆。 1 . 2 ， 6 统计分析 数据用二 土 ， 表示， 组间比较采 用亡 检验 2 实验结果 2 . 1 行为 学检测 A 俘 注射后d 35进行M o 币 5 水
15、 迷宫实验， 记录小鼠找到平台所需要的时间( 潜伏 期) ， 潜伏期越长表明空间辨别能力越差。实验结 果表明， A 日 模型组小鼠的潜伏期长于各剂量组小 鼠， 两 两比 较， 差异有统 计学 意义( p a ol) 。 A p 模 型组小鼠的 潜伏期明显长于正常对照组， 二者比 较， 差异有统计学意义( P 0 . 01) ， 假手术组小鼠与正常 对照 组小鼠 潜伏期比 较， 差异无统计学意义。各剂量 组之间两两比 较， 差异无统计学意义( Fi g l ) 。 小鼠 穿梭程序自 动控制仪记录小鼠 在被动回 避 过程中 受到的电击时间， 电 击时间越长， 表明 学习记 忆障碍越明显。 实验结果
16、显 示， A p 模型组小鼠的电 击时间长于各剂量组小鼠， 两两比较， 差异有统计 学意 义。( 尸 0 . O 1 ) ， A p 模型 组小鼠的电 击时间明 显长于正常对照组， 二者比较， 差异有统计学意义 ( p 0 . 01) 。 假手术组小鼠与正常对照组小鼠潜伏 期比 较， 差异无统计学意义。 各剂量组之间两两比 较， 差异无统 计学意 义( Fi g l ) 。 口 N O n 互 山和七 口 1 例叩 . 5 加 口 1 卿曲。grouP 日 A ， m “ 。 1 脚u p 圈 A p 十 fo w d 、 agegrouP 目 A p 饰 d i ，do s 缪吕 r o l
17、甲 皿 A p +h ighdo s agegro即 团 A p +h1 咖st 面 sa gegro即 Inc 曲a t lo n 件到 叼S ho 腼l g ti 献 F i暇 I E 角火 t 仗F ZS 饱 。 摊 甲 消 甲 . 的近 灯OfJ今 1 冲 口 回d 22 胆碱能系 统检测A 俘 注射后d 37杀死小 鼠， 取出大脑进行C h AT 活性检测， 实验结果表明， A p 模型 组小鼠 大脑中C h A T 活 性低于 各剂量 组， 两 两比 较， 差异有统计学意义( p 0 . 05) ， A p 模型 组 小鼠大脑内的chAT 活性明 显低于对照组， 二者比 较， 差异
18、有统计学意义( p 0 . 01) ， 假手术组小鼠与 正常对照组 ChAT 活性比较， 差异无统计学意义。 各剂量组之间两两比较， 差异无统计学意义( Fi g 2 ) 。 A C h E 活性检测结果表明， A p 模型组小鼠大脑 内A C h E 活性高于各剂量组， 两两比较差异有统计 学意义( p 0 . 0 1 ) ， A p 模型 组大脑内的A C h E 活 性 明 显高于对照组， 二者比 较差异有统计学意义( 尸 0 . 01) ， 假手术组小鼠与正常对照组A ChE活性比 较， 差异无统计学意义。 各剂量组之间两两比 较， 差 异无统计学意义( Fi g 3 ) 。 A C
19、h含量测定结果表明， A 日模型组大脑中 A C h 含量低于各剂量组， 两两比 较， 差异有统计学意 万方数据 1 3 2 4中国药 理学 通报以主 尸 人 召 加砚 诚 呀 交 。 Z B i韶 山 纽 in Z 加7 oct ; 23( 1 0) 义( 尸 0 . 05) ， A p 模型组脑内的A C h 含量明显低 于对照组， 二者比较， 差异有统计学意义( p 0 . 01) ， 假手术组小鼠与正常对照组A Ch 含量比 较， 差异 无统计学意义。 各剂量组之间 两两比 较， 差异 无统计学意义( F i g 4 ) 。 心l201l5110l05阴 四二匕音卜刀留沈6 9590
20、叭 日 2 王 万 匕 d叮下 2 5. 0映T. 右 衬 tyin目 挂b ” 目 .ofA D.团目口泛 之二 ， 口 N oTm 目 c o nt 闰 1 脚uP . 肋 am0 1兄 r a l i ，gro即 日A p m “ el ，uP 圈 A p +low 面 sag。 脚即 目 A 。 +m“ ，阴如缪g r o 叩 皿 A p +h ，沙do ， age尹uP 团 A p +hj乡 1目 。 俪毋gro即 的此 乙0凡月叶飞 众氏众众 加仁二已汐军口盆里吮 、 : ，E 叮 改 t 吐肠 卫 名加 几 d 迢. 川 钊 勺恤 触 b r . 1 .叮A O. 口 血1 面口
21、 恿 。 黔?尹乳 万 每4 】 沮妇 组成f Z 名. A C 为口. 胜 ， 谧 加四 .七 . 加苗冉 目.司 目口 叱 见 3 讨论 研 究 发 现， F zs能 够 对 抗A p 的 细 胞毒 性 3; 改 善A D 模 型鼠 的 空间学习和记 忆能力l， 改善A D 患 者的 行为、 情感及语言能力; sPE C T 半定量法测 定A D 患者局部脑血流量的 研究证实， F zs对额叶、 顶 叶和扣带回的 脑血流量有明显改善作用5。这 些研究结果促使我们对F z S 治疗A D的机制做进一 步的 研究。 在过去的20年里， 人们坚持不懈地努力 去 探究A D 的 发病机制， 从而对
22、该病能 够做到早期 发 现 ， 早 期 治 疗 。 A D 的 相 关 致 病因 素 可 分4 类 困， 首先是基因的多态性， 神经元的凋亡导致脑功能的 损害。 其次是A p的沉积， ta u 蛋白的过磷酸化， 突 触的丢失。第三是免疫反应和炎症过程。第四是兴 奋性中 毒和血管功能异常导致神经元的加速死亡。 所有这些致病过程都是治疗 A D的靶点， 目前大多 数治疗策略主要集中于两个方面， 即日 淀 粉样肤和 胆碱能神经的 传递。而当 前临床用药仍以A C h E 抑 制剂为主， 因其副作用较多且价格昂贵仍未能被普 遍接受， 而且此类药物只对早、 中期A D有改善症状 的作用。中 药治疗疾病具
23、有多靶点的特点， 在发掘 治疗A D的新药方面具有广阔的前景。大量的资料 表明， 多种天然药物而不是单一方向的胆碱酷酶抑 制 剂， 具有治疗认知功能障碍的巨大潜能川。 A 队_ 35 是全长A p 的非生理性毒性片段， 其毒 性与 全长的A p相近。研究证明， P Bs 侧脑室注射小鼠 与正常 小鼠 在 行为学 上未见明显 差别， 但A 日 ” _ ， 侧 脑室注射可导致认知功能障碍。 A D病人脑内 胆碱 能神经受累， 通过增加大鼠 脑内 胆碱能神经或A C h 受 体 的 数量， 可 以 改 善 其 认知 功 能 18. ， 1 。 且A C h 的 丧失与老年斑的数目 及智能的 损害有关
24、。 研究证实 A D 病 人 脑内A C h E 活 性增高 L 。 ， A p 二 _ 3 ， 也 可 通 过 氧化应激使脑内人 C h E活性增高。C h A T 是胆碱能 神经元的特殊标志， 也是催化乙酸胆碱合成的限速 酶， 常用来研究中枢神经系统胆碱能神经元的含量 或 用 作乙酞胆碱含 量的间接指标 1 ” 有学者 报道， A p 二 _ 、 侧脑室注射诱发的A D小鼠模型， 其学习和 记忆功能障碍与胆碱乙酞基转移酶的活性降低有 关【 2 。 本实 验采用A 日 25 _ ， ， 侧脑室注射小鼠 作为 A D 模型， 并检测FzS 对其认知功能及脑内 胆碱能 系 统的 影响， 可客观地
25、反映药物的治疗作用。结果 显示， 不同剂量的FzS 对A D小鼠的认知功能都有 明显的改善作用， 与模型组比 较差异均有统计学意 义( p 005) ， 且均能增强A D 小鼠 脑内的ChAT 活 性， 降低A chE 活性， 增加A Ch 含量， 与模型组比较 差异均有统计学意义( 尸 0 . 0 5 ) 。虽然在中等剂量 万方数据 中国药 理学通报C 丙 诬 ness 几 加。 c O 2 口 加心B “ 2 趾 haZ 叨7 优t ; 23( 1 0) 1 3 2 5 时， 各种检测指标有改善的 趋势， 但各剂量组之间两 两比 较， 差异无统计学意义。所以我们认为， FzS 可 通过对A
26、 D 小鼠 脑内 胆碱能系统的调节来改善其认 知功能， 从而达到治疗A D的效果， 且F Z S 在低剂量 时已经具有了最大效应。我们还将对FzS 治疗A D 的机制做进一步的研究。 参考文献: 1 1 城 ” is J ， 、 “ 咫山 e 而 。 d 血.h 吵 h u 汕 es J . 2 ， 力 “ 血 吮 of 尸 力 口 用 如 。 如 助田 翻 才 爪 找 1“ 肠 幻 户 ， A co 丈 跄 畔 of月 砚 “ 口 。Med 众 ” 之 反 呻， Be公 众 召 1 0085 0 ， 以饭 na A bst r a ct: A j 卫 uTO e xam i n et 卜 e
27、e ffec t sof F u z h i s a n ( FZS ) o n th e A l z h e i m e r ， 。 d i s e as e( A D ) m o d e l m i c e i n d u c 司b y i n t ，e r e l r Iv e n tri c u l arA p 乃 _ 。M e th o ds The A Dm o d e l of而c e was es t a h l i s h e d 师t h e i nj e c ti on o f A p 二 _ 。 i nto th e l a t e ral c ere】 r a l v
28、 e n t ri c l e . The c o 合 ni ti ve曲i l i tyoft h e A Dm o d e l m i c e w asd e te c t e d 场th e w at e r n l a z et est andtheshu t il e场xtes t .Thea c t i vit i e s Of e t y l c h o l i n e s te rase( A C h E )andc h o l i n eac etyl - t ra n sferase( C h A T )i nt h eb ra i n s weree x ami n e
29、dh y t h e。 0 1 0 石 m 颇。m e th o d .The e t y l c h ol i n e( A C h ) c o n te n t w ase x a m i n e db yth e司 k al i n eh yd r l ” l a m i n e col o ri m e t ri cm e t h od.ResultSThe C h i n e s e h e thal med i c i n e F Z S n o t o 记 y e ffec t i v e l y i m p ro v e d th e l e arni n g and m e
30、m o 叮abi l i t i e s oft h e A Dl l l l记 e l m i c e i n th e w a l e r m az e a n d step 一 t h rough te s t s ， b utal soa m e l i o rate dth e d e c l i n e d C h AT ac 丘 v i fyandA c hc o n t e n t i nt he b rain a n dd e c reas ed t h eel e v at e dA c h Ea c t i v i t y .T h eFZS was d 璐 e 一 d
31、e P e n d e n d y e 月 记 c l i v e i n t h e thera p y ofA Di n m ic e 二乡 嗯froml . 2 5tol og k g 一 ， ， h owe v erit 5 卜 o w e d o p t i m alt 卜 e raneu t i c e 佼 datth e d o s 娜 ofZ . 5 9 k g 一 1 . c ond usio n 几e Fzs c o m p o u n d s re ， l at e ，da m e l i o ra t eth ec h o l i n e 匆。fo n c ti onsofth eA D - n l 司e l 面c e ， th e r e b y ac 址 e v e i l s th e rane u t i c e 价c t . K e y 叨 o r d : F u zh i o an; Alz卜 e i m e d i se ， ; c h o l in e ac e t y l- tran s fe ; ac e l y l c h o l j n 璐 t e rase ; ac e ty l c h o l i n e ; c o ，1 - t i v e a b i l i ty 万方数据