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1、第1 0 卷第2 期 2 0 0 8 年4 月 中国当代儿科杂志 C h i nJC o n t e m pP e d i a t r V 0 1 1 0N o 2 A p r 2 0 0 8 实验研究 断乳前丰富环境对即刻早期基因A r e 的表达及长时记忆的影响 陆澄秋，钟乐，田英，颜崇淮，沈晓明 ( 上海交通大学医学院附属新华医院上海市儿科医学研究所上海市环境与儿童健康重点实验室。上海2 0 0 0 9 2 ) 摘要】目的探讨断乳前丰富环境对大鼠海马即刻早期基因一活性调节的细胞骨架蛋白( a c t i v i t y r e g u l a - t e dc y t o s k e l
2、 e t a lp r o t e i n ，A r c ) 的表达，以及对长时记忆的影响。方法4 窝共4 0 只新生S D 大鼠，每窝随机分为对照 组( 1 , = 2 0 ) 和实验组( n = 2 0 ) ，实验组大鼠生后1 0 日龄至2 4 日龄每天予以丰富环境暴露2 0m i n ，对照组大鼠除不 予以丰富环境暴露外，其余处理均与实验组相同。生后2 8d ，两组大鼠予以旷场行为测试其自发活动，新物体识别 测试评估其长时记忆能力，采用免疫印迹方法检测断乳前丰富环境对海马即刻早期基因A r e 表达量的影响，并且 通过免疫荧光的方法观察两组间A r e 在海马C A l 和D G 区的表
3、达差异。结果两组大鼠在旷场行为测试中，穿行 方格的次数差异没有显著性( t = 0 6 3 2 ，P 0 0 5 ) ，而在新物体识别测试中，实验组大鼠的1h 和2 4h 的成绩差异 有显著性( t = 一2 3 7 ，P 0 0 5 ) ，表明短暂的丰富环境暴露对两组动物的 自发活动没有影响。 2 1 2 新物体识别测试 新物体识别方法检测 结果见图l 。在训练过程中，两组幼鼠对物体都没 有明显偏好( t = 一0 3 2 ，P 0 0 5 ) ，偏好系数约等 于5 0 。但在lh 和2 4h 后，丰富环境暴露组明显 地偏好新的物体，偏好系数分别为( 5 9 6 1 9 6 1 ) ， (
4、6 2 7 24 - 1 4 1 2 ) ，而对照组则几乎没有表现出偏好 ( 5 0 4 64 - 9 3 4 ) ，( 5 2 3 9 9 1 6 ) ，两组的偏好系 数之间存在明显差异( t = 一2 3 7 ，P 0 0 5 ；t = 一2 1 3 ，P 0 0 5 ) 。结果提示，丰富环境组比对 照组幼鼠表现出更好的长时记忆能力。 2 2 免疫印迹检测A r c 的表达变化 以G A P D H 为内参，用免疫印迹技术分别检测 了丰富环境组和对照组海马A r c 蛋白的表达水平， 结果显示，在G A P D H 表达水平基本一致的情况 下，丰富环境组海马的A r c 蛋白表达明显高于对
5、照 组，差异具有显著性( t = 一5 7 7 ，P 0 0 1 ) 。见 图2 。 图1 新物体识别测试。训练1h 和2 4h 后，丰富环境组的 偏好系数明显高于对照组，a ：P O 0 5 。 图2 大鼠海马组织A r c 蛋白表达结果。1 ：代表对照 组；2 ：代表丰富环境组。用G A P D H 抗体检测同一张膜作内对照，显 示丰富环境组A r c 的密度明显高于对照组。 2 3 免疫组织化学染色检测A r c 的表达部位 免疫荧光观察了海马C A I 和D G 区的A r c 表达 情况，发现在C A l 和D G 区都有A r c 的表达，D G 区的 表达要高于C A l 区。幼
6、鼠经历丰富环境后，C A l 和 D G 区的A r e 表达比在标准环境中的幼鼠高。此结果 与免疫印迹对A r c 蛋白的定量分析一致( 图3 ) 。 图3 丰富环境对海马D G 区和C A l 区A r c 蛋白表达的影响( 1 0 0 ) A ：X C N g l D G 区；B ：丰富环境组D G 区；C ：X , L 熙1 1 C A l 区；D ：丰富环境组C A l 区。免疫荧光显示丰富环境暴露的大鼠海马I X ；区和C A l 区A r c 蛋白的荧光强度和密度均比对照组高。标示细胞 层；J 标示分子层。 1 8 1 万方数据 第l O 卷第2 期 2 0 0 8 年4 月 中
7、国“ - 3 代儿科杂志 C h i nJC o n t e m pP e d i a t r V 0 1 1 0N o 2 A p r 2 0 0 8 3 讨论 本实验发现断乳前丰富环境对大鼠的自发活动 没有影响，但是短暂暴露于丰富环境的大鼠在新物 体识别测试中表现出比对照组更好的长时记忆。断 乳前与成年时的丰富环境存在一定的差别0 J 。表 现在：断乳前丰富环境发生在生长发育期，该期大 脑的结构和功能还没有完善，处于对环境的敏感期； 断乳前丰富环境还包括了母仔关系，母鼠的哺育 行为。有实验证实成年动物的丰富环境可促进其学 习记忆能力，本实验发现断乳前的丰富环境也能 促进长时记忆。以往研究断
8、乳前丰富环境，都是将 母鼠与仔鼠置于同一丰富环境中1 | ，而实际上，母 鼠的行为也会影响到仔代，因而本研究在实验设计 中避免了这一干扰，并且排除了短暂的母仔分离，操 作者的搬动以及相互交往这三个因素的影响。由于 新生动物的特殊性，主动运动的能力比成年动物小， 在断乳前丰富环境中的幼鼠并不能完全利用增加的 运动机会，其运动能力的提高并不明显，而动物的自 发活动与其本身的运动能力相关，这可能是丰富环 境暴露与对照组大鼠之间自发活动没有差异的原 因。 周围环境的刺激能改善脑结构，提高脑功 能2 | ，而增加的神经营养因子，神经递质受体的改 变和即刻早期基因的表达均是可能的机制。本研究 中免疫印迹实
9、验发现暴露于丰富环境的大鼠海马表 达的A r c 蛋白明显高于对照组；免疫荧光实验也证 实，在与学习记忆密切相关的海马C A l 区、D G 区， 丰富环境组表达的A r c 要明显高于标准环境组。兴 奋性刺激使海马N M D A 受体活化，A r em R N A 转录 增加，并翻译为蛋白，在活化的突触部位起作用MJ 。 A r c 蛋白影响微管相关蛋白复合体聚合3 | ，通过与 神经元骨架相互作用，影响神经元突触的结构可塑 性，改变神经元对信息的获取和巩固功能。抑制海 马A r c 的表达则损伤长时程增强的维持和长时记忆 的巩固J ，提示A r c 蛋白与突触功能可塑性和长时 记忆有关。本
10、实验观察到断乳前丰富环境暴露组和 对照组大鼠，。A r c 蛋白的表达具有差异。A r c 蛋白表 达量的增加，增强了神经元的突触可塑性，提高了神 经元处理信息的能力，巩固了长时记忆。当然，要证 实A r c 蛋白是断乳前丰富环境促进长时记忆的分子 机制还需进一步实验验证。 目前，对断乳前丰富环境的研究仍停留在行为 学水平，对于其分子机制的研究还没有完全展开。 事实上，哺乳动物的断乳前是脑发育的关键时期，对 此期脑的研究有助于我们探讨认知发育的关键因 素，为提供促进脑发育和恢复脑损伤后脑功能的方 案开辟新的路径。 参考文献 1 B r u e l J u n g e r m a nE ，L a
11、 r o c h eS ，R a m p o nC N e wn e u r o n si nt h e d e n t a t eg y r u sa r ei n v o l v e di nt h ee x p r e s s i o no fe n h a n c e dl o n g t e r m m e m o r yf o l l o w i n ge n v i r o n m e n t a le n r i c h m e n t J E u rJN e u r o s c i ， 2 0 0 5 ，2 1 ( 2 ) ：5 1 3 - 5 2 1 2 W o o d c
12、 o c kE A ，R i c h a r d s o nR E f f e c t so fm u l t i s e n s o r ye n v i r o n m e n - t a ls t i m u l a t i o no nc o n t e x t u a lc o n d i t i o n i n gi nt h ed e v e l o p i n gr a t J N e u r o b i o lL e a r nM e r e ，2 0 0 0 ，7 4 ( 2 ) ：8 9 1 0 4 3 W i l l i a m sB M ，L u oY ，W a r
13、dC ，R e d dK ，G i b s o nR ，K u c z a jS A ，e t a 1 E n v i r o n m e n t a le n r i c h m e n t ：e f f e c t so ns p a t i a lm e m o r ya n dh i p p o c a m p a lC R E Bi m m u n o r e a c t i v i t y J P h y s i o lB e h a v ，2 0 0 1 ，7 3 ( 4 ) ：6 4 9 - 6 5 8 4 韩太真，吴馥梅学习与记忆的神经生物学 M 北京：北京 医科大学中国协和
14、医科大学联合出版社，1 9 9 8 ，1 6 2 5 G o b b oO L ，0 M a r aS M I m p a c to fe n r i c h e d e n v i r o n m e n th o u s i n g o nb r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i ef a c t o ra n do nc o g n i t i v ep e r f o r m a n c e a f t e rat r a n s i e n tg l o b a li s c h e m i a J B e h a vB r a i n
15、R e s ，2 0 0 4 ，1 5 2 ( 2 ) ：2 3 1 - 2 4 1 6 G u z o w s k iJ F ，L y f o r dG L ，S t e v e n s o nG D ，H o u s t o nF P ，M c G a n g h J L ，W o r l e yP F ，e ta 1 I n h i b i t i o no fa c t i v i t y - d e p e n d e n ta r cp r o t e i n e x p r e s s i o ni nt h er a th i p p o c a m p u si m p a
16、i r st h em a i n t e n a n c eo fl o n g t e r mp o t e n t i a t i o na n dt h ec o n s o l i d a t i o no fl o n g t e r mm e m o r y J J N e u r o e c i ，2 0 0 0 ，2 0 ( 1 1 ) ：3 9 9 3 - 4 0 0 1 7 S t e w a r dO ，W o r l e yP L o c a ls y n t h e s i so fp r o t e i n sa ls y n a p t i cs i t e s
17、 o nd e n d r i t e s ：r o l ei ns y n a p t i cp l a s t i c i t ya n dm e m o r yc o n s o l i d a t i o n J N e u r o b i o lL e a r nM e m ，2 0 0 2 ，7 8 ( 3 ) ：5 0 8 - 5 2 7 8 钟乐，颜崇淮，黄华，陆澄秋，徐健，沈晓明断乳前丰富环 境促进大鼠空间记忆及基于基因芯片研究的机制探讨 J 中华儿科杂志，2 0 0 7 ，4 5 ( 1 0 ) ：7 8 1 - 7 8 3 9 钟乐，颜崇淮，黄华，陆澄秋，徐健，余晓刚，等
18、断乳前丰富环 境暴露促进海马神经发生及其机制研究 J 中华医学杂志， 2 0 0 7 ，8 7 ( 2 2 ) ：1 5 5 9 1 5 6 3 1 0 K o h lZ ，K u h nH G ，C o o p e r - K u h nC M ，W i n k l e rJ ，A i g n e rL ， K e m p e r m a n nG P r e w e a n i n ge n r i c h m e n th a sn ol a s t i n ge f f e c t so n a d I d th i p p o c a m p a l n e u r o g e n
19、e s i si n f o u r - m o n t h - o l d m i c e J G e n e sB r a i nB e h a v ，2 0 0 2 ，l ( 1 ) ：4 6 - 5 4 1 1 C a n c e d d a L ，P u t i g n a n o E ，S a l eA ，V i e g iA ，B e r a r d iN ，M a f f e iL A c c e l e r a t i o no fv i s u a ls y s t e md e v e l o p m e n tb ye n v i r o n m e n t a le
20、n r i c h m e n t J JN e u r o s c i ，2 0 0 4 。2 4 ( 2 0 ) ：4 8 4 0 - 4 8 4 8 1 2 v a nP r a a gH ，K e m p e r m a n nG ，G a g eF H N e u r a lc o n s e q u e n c e so f e n v i r o n m e n t a le n r i c h m e n t J N a tR e vN e u m s c i ，2 0 0 0 ，l ( 3 ) ： 1 9 1 1 9 8 1 3 F u j i m o t oT ，T a n
21、 a k aH ，K u m a m a r uE ，O k a m u r aK 。M i k iN A r c i n t e r a c t sw i t hm i c r o t u b u l e s m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n2a n d a t t e n u a t e sm i e r o t u b u l e - a s s o c i a t e dp r o t e i n2i m m u n o r e a c t i v i t yi nt h e d e n d f i t e s J JN e u r o s c iR e s ，2 0 0 4 ，7 6 ( 1 ) ：5 1 - 6 3 1 8 2 ( 本文编辑：吉耕中) 万方数据