SN-T-1354-2004.pdf

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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 3 5 4 -2 0 0 4 进出口蜂蜜中咖啡因含量检验 方法液相色谱法 D e t e r mi n a t i o n o f c a f f e i n e i n h o n e y f o r i m p o r t a n d e x p o r t -L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布 2 0 0 4 - 1 2 - 0 1实施 中华人民共和国 国家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 S N/ T 1 3 5 4

2、-2 0 0 4 月U吕 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。 本标准由中华人民共和国湖南出人境检验检疫局负责起草. 本标准主要起草人: 戴华、 李拥军、 熊芳、 李献坤、 黄志强、 袁智能。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 S N / T 1 3 5 4 -2 0 0 4 进出口蜂蜜中咖啡因含量检验 方法液相色谱法 范 围 本标准规定了进出口蜂蜜中咖啡因含量检验的抽样、 制样和液相色谱测定方法。 本标准适用于进出口蜂蜜中咖啡因含量的检验。 2 抽样 和制样 21 检验批 以不超过 1 0 0 0 件( 或 2 5 t ) 为一检验批。 同一检验

3、批的商品应具有相同的特性， 如包装、 标记、 产地、 规格和等级等。 2 . 2 抽样数f 抽样数量见表 1 . 表 1单 位 为件 批 量 最 低抽 样 数 1 - 1 01 1 1 - -5 05 5 1 - 1 0 01 0 1 0 1 - 5 0 0 每增加1 0 0 ， 增取5 5 0 1 以 上 每增加1 0 0 . 增取2 2 . 3抽样工具 2 . 3 . 1 取样管: 不锈钢管， 长约 1 1 5 c m， 内径约2 . 5 c m; 玻璃管， 长约 1 1 5 c m， 内径约 2 . 5 c m. 2 . 3 . 2 混样器: 搪瓷桶( 或杯) 。 2 . 3 . 3 样

4、品瓶. 5 0 0 mL具塞广口玻璃瓶。 2 . 4 抽样方法 按 2 . 2 规定的抽样件数随机抽取， 逐件开启将玻璃管缓缓从开口处放人直至桶底， 吸取样品。如 遇蜂蜜结晶， 用不锈钢管缓缓插人， 直至桶底， 吸取样品。每件抽取样品不少于 1 0 0 g作为原始样品。 将所取样品倾人混样器内， 混合均匀， 分出约 1k g ， 装人清洁干燥的样品瓶内， 加封后， 标明标记， 及时 送交实验室 。 如属瓶装蜂蜜， 按应开件数， 从每件中随机取一瓶， 标明标记， 及时送交实验室。 2 . 5 试样制备 将取回样品充分搅匀， 均分成两份， 装人试样瓶中作为试样， 密封， 标明标记。 如取回样品中有

5、结晶析出， 则将样品瓶加盖后， 置于不超过 4 0 的水浴中温热。待结晶全部融化 后， 启盖， 充分搅匀， 均分成两份， 密封， 并标明标记。 如属瓶装蜂蜜， 将取回的全部蜂蜜， 倒在一起， 充分搅匀， 分取出约 1 k g 代表性样品。再将 1 k g 代 表性样品经搅匀后， 均分成两份， 装人试样瓶中作为试样， 密封， 标明标记。在抽样和制样的操作过程 S N/ T 1 3 5 4 -2 0 0 4 中， 应防止样品受到污染或发生含量的变化。 2 . 6试样保存 将试样于室温下保存。 测定方法 3 . 1 方法提要 样品中咖啡因在碱性条件下， 用三抓甲烷提取， 提取液经净化、 浓缩后， 用

6、配有紫外检测器的液相色 谱仪测定， 外标法定量. 3 . 2 试剂和材料 所有试剂除特殊注明外， 均为分析纯， 水为重蒸馏水。 3 . 2 . 1 乙睛: 液相色谱纯或相当者。 3 . 2 . 2 冰乙酸: 9 9 . 9 0 0 , 3 . 2 . 3 三抓甲烷。 3 . 2 . 4 氢氧化钠水溶液: 称取 5 . 0 g 氢氧化钠用 1 0 0 mL水溶解。 3 . 2 . 5 咖啡因: 纯度)9 9 . 5 环。 3 . 2 . 6 标准溶液( 1 m g / m L ) : 准确称取0 . 1 g ( 准确至。 . 0 0 0 1 g ) 咖啡因标准品， 用水溶解并定容至 1 0 0

7、MI ， 作为标准储备液。再根据需要用水将标准储备液稀释至适当浓度。 3 . 3 仪器和设备 3 . 3 . 1 高效液相色谱仪配紫外检测器。 3 . 3 . 2 旋涡混匀器。 3 . 3 . 3离心机 : 4 0 0 0 r / mi n , 3 . 3 . 4 多功能微量化样品处理仪或类似者。 3 . 4 测定步骤 3 . 4 . 1 提取、 净化 准确称取 2 0 g ( 准确至 。 . 0 1 g ) 试样于 5 0 mL具塞离心管中， 加人1 0 mL氢氧化钠水溶液混匀， 然 后定量加人 2 0 . 0 mL三氯甲烷， 加塞， 在旋涡混匀器上混匀 5 m i n . 于2 0 0 0

8、 r / m i n离心5 mi n ， 将上层水 相用尖嘴吸管吸取弃去， 有机相再用 2 X5 mL氢氧化钠水溶液洗涤两次， 弃去水相; 将有机相在旋涡混 合器上混匀， 用干燥滤纸过滤， 弃去初液 3 mL ， 收集滤液， 定量取滤液 1 0 . 0 mL ， 于 4 5 空气流下浓缩 至近干， 定量加人 2 . 0 mL水溶解残渣， 过 。 . 4 5 K m微孔滤膜后， 上液相色谱仪测定， 外标法定量。 3 . 4 . 2测定 3 . 4 . 2 . 1 色谱条件 a ) 色谱柱: O D S C 1 8 柱， 2 5 c m X 4 . 6 m m ( 内 径) X 5 y m或类似柱

9、; b ) 流动相: 乙睛 : 水 : 乙酸( 1 6 +8 3 +1 ) ; c ) 流速 : 0 . 5 0 mL/ mi n ; d ) 检测 波长 : 2 7 3 n m; e ) 进样量, 2 0 I L ; f ) 柱温 ; 4 0 0C。 3 . 4 . 2 . 2 色谱测定 根据样液中咖啡因的含量情况， 选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中的咖啡 因的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱 条件下， 咖啡因的保留时间约为8 . 8 mi n ， 标准品色谱图参见附录A, 3 . 4 . 3 空白试验 除不加试样外， 按

10、上述测定步骤进行。 2 S N/ T 1 3 5 4 -2 0 0 4 3 . 5 结果计算和表述 用色谱数据处理机或按式( 1 ) 计算试样中咖啡因的含量， 计算结果需扣除空白值。 (1 V- 式中 : X 试样中咖啡因的含量， 单位为毫克每千克( m g / k g ) ; A 样液中咖啡因的峰面积， 单位为平方毫米( m m ) ; c , 标准工作液中咖啡因的浓度， 单位为微克每毫升( p g / -L ) ; A . 标准工作液中咖啡因的峰面积， 单位为平方毫米( m m ) ; V 样液最终定容体积， 单位为毫升( m L ) ; 二 最终样液所代表的试样量， 单位为克( 9 )

11、。 测定低限、 回收率 4 . 1 测定低限 本方法的测定低限为。 . 0 2 5 m g / k g , 4 . 2 回收率 蜂蜜中咖啡因的添加浓度及其回收率的实验数据: 在0 . 0 2 5 m g / k g 时， 回收率为9 3 . 2 %; 在0 . 0 5 0 m g / k g 时， 回收率为9 6 . 0 %; 在 1 . 0 mg / k g 时， 回收率为9 8 . 4 0 a , S N/ T 1 3 5 4 -2 0 0 4 附录A ( 资料性 附录) 标 准品色谱图 . A b s I不一:h l 2 7 3 n m 团囚团哭网誉月 图 A.咖啡因标准品的液相色谱 图

12、 S N / T 1 3 5 4 -2 0 0 4 F o r e wo r d A n n e x A o f t h is s t a n d a r d a r e i n f o r ma t i v e a n n e x. T h is s t a n d a r d w a s p r o p o s e d b y a n d is u n d e r t h e c h a r g e o f N a t i o n a l R e g u la t o r y C o m mi s s io n f o r C e r t if i c a t i o n a n d Ac

13、 c r e d it a t i o n . T h i s s t a n d a r d w a s d r a f t e d b y H u n a n E n t r y - E x i t In s p e c t i o n a n d Q u a r a n t i n e B u r e a u o f t h e P e o p le s R e p u b li c o f C h i n a . T h e m a in d r a f t e r s o f t h i s s t a n d a r d a r e D a l H u e , L i Y o n

14、g j u n , X i o n g F a n g , L i X ia n k u n , H u a n g Z h iq ia n g a n d Y u a n Z h i n e n g . T h is s t a n d a r d i s a p r o f e s s io n a l s t a n d a r d p r o m u lg a t e d f o r t h e f i r s t t i m e . N o t e : T h i s E n g li s h v e r s io n , a t r a n s l a t io n f r o m

15、 t h e C h i n e s e t e x t , i s s o l e ly f o r g u i d a n c e S N/ T 1 3 5 4 -2 0 0 4 D e t e r min a t i o n o f c a f f e in e i n h o n e y f o r i mp o r t a n d e x p o r t -L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y 1 S c o p e T h is s t a n d a r d s p e c i f i e s t h e m e t h o d s o

16、f s a mp l i n g , s a mp l e p r e p a r a t io n a n d d e t e r min a t io n o f c a f f e i n e c o n t e n t s i n h o n e y f o r e x p o r t b y l i o u id c h r o ma t o g r a o h v. T h i s s t a n d a r d i s a p p l ic a b le t o t h e d e t e r m i n a t io n o f c a f f e in e c o n t e

17、 n t s in h o n e y f o r e x p o r t b y l iq u id c h r o m a t o g r a p h y . 2 S a mp l i n g a n d s a m p l e p r e p a r a t i o n 2 . 1 I n s p e c t i o n l o t E a c h i n s p e c t io n l o t s h o u ld n o t e x c e e d 1 0 0 0 p a c k a g e s ( o r 2 5 t ) . T h e c h a r a c t e r i s

18、 t i c s o f t h e c a r g o wit h in t h e s a me i n s p e c t io n lo t , s u c h a s p a c k i n g , ma r k , o r ig i n , s p e c i f i - c a t i o n a n d g r a d e , s h o u ld b e t h e s a me . 2 . 2 Q u a n t i t y o f s a m p l e t a k e n Q u a n t i t y o f s a mp le t a k e n s e e t a

19、 b le 1 . Ta b l e 1 N u mb e r o f p a c k a g e s i n a n in s p e c t io n l o t Min imu m n u mb e r o f p a c k a g e s t o b e t a k e n 1 - 1 0 1 1 1 - 5 0 5 1 - 1 0 0 1 0 1 01 - 50 0 5 mo r e p a c k a g e s f o r e v e ry in c r e me n t o f 1 0 0 p a c k a g e s 5 0 1 - 1 0 0 0 2 m o r e p

20、 a c k a g e f o r e v e ry i n c r e m e n t o f 1 0 0 p a c k a g e s 2. 3 S a mp l in g t o o l s 2 . 3 . 1 S a m p l in g t u b e : S t a i n le s s s t e e l t u b e , le n g t h t u b e, le n g t h: c a 1 1 5 c m, in t e r n a l dia me t e r : c a 2 . 5 c m c a 1 1 5 c m, in t e r n a l d ia m

21、e t e r : c a 2 . 5 c m; g l a s s 2. 3. 2 Mi x in g v e s s e l : E n a me l d r u m( o r c u p ) 2 . 3 . 3 S a mp le b o t t l e : 5 0 0 m L , wi d e - m o u t h e d g l a s s b o t t le , wi t h g r o u n d s t o p p e r . S a m口 i n g p r o c e d u r e a n u mb e r o f s a mp le p a c k a g e s

22、s p e c i f ie d i n 2 . 2 a t r a n d o m a n d o p e n t h e p a c k a g e s o n e b y o n e S N/ T 1 3 5 4 -2 0 0 4 T a k e t h e s a mp le f r o m t h e p a c k a g e b y i n s e r t in g s l o wl y t h e s a mp l i n g t u b e t o t h e b o t t o m. I f t h e h o n e y i s c rys t a l l iz e d

23、, p e n e t r a t e t h e s t a i n le s s s t e e l t u b e t o t h e b o t t o m o f t h e c o n t a in e r . T h e s a mp le t a k e n f r o m e a c h p a c k a g e s h o u l d n o t b e l e s s t h a n 1 0 0 g a s a p r i m a ry s a mp le . P o u r t h e d r a wn s a mp le i n t o t h e mix in g

24、 v e s s e l , a n d mi x t h o r o u g h ly . D r a w c a 1 k g o f t h e mi x e d s a mp le a n d p la c e i n a c le a n d ry s a mp le b o t t le, s e a l , la b e l a n d s e n t t o t h e la b o r a t ory i n t ime . I f t h e h o n e y wa s p a c k e d in b o t t le s in s i d e t h e p a c k

25、 a g e , d r a w o n e b o t t l e f r o m e a c h o f t h e p a c k a g e s . L a b e l a n d s e n d t o t h e la b o r a t o ry in t i me . 2 . 5 P r e p a r a t i o n o f t e s t s a mp le Mi x a l l t h e s a mp le s t a k e n b a c k t h o r o u g h ly , a n d d i v i d e in t o t wo e q u a l

26、 p o r t io n s . E a c h p o r t i o n i s p la c e d in a s a mp le b o t t le a s t h e t e s t s a mp l e , wh ic h i s s e a le d a n d la b e l e d . I f t h e s a mp le t a k e n b a c k b e c o m e s c ry s t a l li z e d , m e l t i t b y w a r m i n g i n w a t e r - b a t h b e lo w 4 0 0

27、C w i t h t h e s a m p le b o t t le c o v e r e d t ig h t l y . Wh e n t h e s a m p l e h a s c o mp le t e ly me lt e d , r e m o v e t h e c o v e r a n d mi x t h o r o u g h ly . D iv id e i n t o t w o e - q u a l p o r t io n s , e a c h p o r t i o n i s p l a c e d i n a s a m p l e b o

28、t t l e a s t h e t e s t s a mp le , s e a le d a n d la b e le d . F o r b o t t le - p a c k e d h o n e y , p o u r a l l t h e h o n e y t a k e n b a c k i n t o a v e s s e l a n d mi x t h o r o u g h ly . D r a w c a 1 k g o f t h e r e p r e s e n t a t iv e s a mp l e , mix we l l a n d d

29、 iv id e in t o t wo e q u a l p o r t io n s . E a c h p o r t io n i s p la c e d in a s a mp le b o t t le a s t h e t e s t s a mp le , s e a le d a n d l a b e le d . I n t h e c o u r s e o f s a m p l in g a n d s a m p l e p r e p a r e - t i o n , p r e c a u t io n s s h o u l d b e t a k

30、e n t o a v o id c o n t a mi n a t i o n o r a n y f a c t o r s wh ic h m a y c a u s e t h e c h a n g e o f c o n t e n t . 2. 6 The S t o r a g e o f t e s t s a mp le t e s t s a mp le s s h o u l d b e s t o r e d a t r o o m t e mp e r a t u r e . 3 Me t h o d o f d e t e r mi n at ion 3 . 1

31、 P r in c i p le T h e c a f f e in e is e x t r a c t e d f r o m t h e t e s t s a mp l e wit h c h lo r o f o r m u n d e r a lk a li n e c o n d it i o n , t h e n t h e e x - t r a c t i s c le a n e d u p a n d c o n c e n t r a t e d b e f o r e d e t e r mi n a t io n b y H P L C wit h U V d

32、 e t e c t o r . E x t e r n a l s t a n d a n d me t h o d is u s e d f o r q u a n t if i c a t io n . 3 . 2 R e a g e n t s a n d ma t e r i a l s U n le s s o t h e r wis e s p e c i f ie d , a ll r e a g e n t s a r e s h o u l d b e a n a ly t i c a l p u r e , “ wa t e r “ i s r e d i s t i l

33、 le d wa t e r . 3 . 2 . 1 Ac e t o n it r i le: HP L C gr a d e or e q uiv a l e n t 3 . 2 . 2 Ac e t i c a c i d g la c i a l , 9 9 . 9% 3 . 2 . 3 C h lo r o f o r m 3 . 2 . 4 S o d i u m h y d r o x id e s o l u t io n : D i s s o lv e d 5 . 0 g o f N a O H i n 1 0 0 mL wa t e r S N/ T 1 3 5 4 -2

34、 0 0 4 3 . 2 . 5 C a f f e i n e : p u r it y -9 9 . 5 %. 3 . 2 . 6 S t a n d a r d s o l u t i o n : We i g h a c c u r a t e ly a b o u t 0 . 1 g ( a c c u r a t e t o 0 . 0 0 0 1 g ) c a f f e i n e s t a n d a r d in t o a 1 0 0 mL v o l u me t r i c f la s k . D i s s o l v e a n d ma k e u p t

35、 o m a r k wit h w a t e r a s t h e s t a n d a r d s t o c k s o lu t io n . D i lu t e t h e s t a n d a r d s t o c k s o lu t i o n wi t h wa t e r t o t h e r e q u ir e d c o n c e n t r a t io n a s t h e s t a n d a r d w o r k i n g s olu t i o n . 3 . 3 A p p a r a t u s a n d e q u i p m

36、e n t 3 . 3 . 1 H P L C e q u i p p e d wi t h U V d e t e c t o r . 3 . 3 . 2 Mi x e r 3. 3. 3 C e n t r i f u g e : 4 0 0 0 r / min . 3. 3. 4 Mu l t if u n c t i o n s a mp le t r e a t me n t u n it mi c r o c h e mic a l me t h o d or e q u i v a l e n t 3. 4 P r o c e d u r e 3 . 4 . 1 E x t r

37、a c t io n a n d c le a n - u p We i g h 2 0 g ( a c c u r a t e t o 0 . 0 1 g ) s a mp le i n t o 5 0 mL c e n t r i f u g e t u b e wit h s t o p p e r , a d d 1 0 mL s o d iu m h y d r o x i d e s o lu t io n , mi x f o r 1 min . T h e n a d d e d 2 0 . 0 mL c h lo r o f o r m o f t h e e x t r a

38、 c t i n t o t h e c e n t r i f u g e t u b e s e a le d , mix o n a mix e r f o r 5 min , c e n t r i f u g a l i z e a t 2 0 0 0 r / mi n f o r 5 mi n , d r a w o u t t h e wa t e r la y - e r wi t h a c a p i l la r y t i p p e d p ip e t t e a n d d i s c a r d . t h e n t r e a t e d t h e o r

39、 g a n i c l a y e r wit h 2 x 5 m L s o d i u m h y - d r o x i d e s o l u t i o n t wo t ime s , d r a w o u t t h e wa t e r la y e r a n d d i s c a r d . T h e e x t r a c t w a s f i lt e r b y d ry f i lt e r p a p e r a n d d is c a r d t h e p r e v i o u s 3 mL f il t r a t e , c o l le c

40、 t t h e f il t r a t e a n d p i p e t 1 0 . 0 mL f i lt r a t e a n d e v a p o - r a t e t o n e a r d ryn e s s u n d e r a s t r e a m o f a i r a t 4 5 C . D is s o lv e t h e r e s i d u e in 2 . 0 mL wa t e r , a n d t h e f i lt e r t h r o u g h 0 . 4 5 u m me mb r a n e f i lt e r . T h e

41、 s olu t io n i s u s e d f or HP L C d e t e r m in a t io n . 3 . 4. 2 D e t e r m in a t io n 3 . 4 . 2 . 1 H P L C o p e r a t in g c o n d it i o n a ) C o l u mn : O D S C 1 8 c o lu m n 2 5 c m x 4 . 6 m m( i . d) x 5 u m p a r t i c l e s i z e o r e q u i v a l e n t ; b ) M o b i le p h a

42、s e : A c e t o n it r i le : wa t e r : a c e t i c a c id ( 1 6 +8 3 +1 ) ; c ) F l o w r a t e : 0. 5 0 mL / mi n ; d ) D e t e c t o r wa v e le n g t h : 2 7 3 n m; e ) In j e c t i o n v o lu me : 2 0 p L , f ) C o lu mn t e m p e r a t u r e : 4 0 C 3 . 4 . 2 . 2 L C d e t e r m in a t ion A

43、c c o r d i n g t o t h e a p p r o x i m a t e wo r k i n g s o l u t i o n wit h s i mi la r c o n c e n t r a t i o n o f c a f f e in e in t h e s a mp l e s o lu t io n , s e l e c t p e a k a r e a t o t h a t o f t h e s a mp le s o lu t io n . T h e r e s p o n s e s t h e s t a n d a r d o

44、f c a f f e in e in S N/ T 1 3 5 4 -2 0 0 4 t h e s t a n d a r d w o r k i n g s o l u t io n a n d s a mp le s o lu t i o n s h o u l d b e wi t h in t h e li n e a r r a n g e o f t h e in s t r u me n - t a l d e t e c t io n . T h e s t a n d a r d w o r k in g s o lu t i o n s h o u ld b e r a

45、 n d o mly i n j e c t e d in - b e t we e n t h e i n j e c t io n s o f t h e s a mp le s o lu t io n o f e q u a l v o lu m e . U n d e r t h e a b o v e o p e r a t in g c o n d i t io n , t h e r e t e n t io n t ime o f c a f - f e i n e i s a b o u t 8 . 8 min. F o r c h r o ma t o gr a m o f

46、 t h e s t a n d a r d , s e e F i g A. t i n a n n e x A. 3 . 4. 3 Bla n k t e s t T h e o p e r a t i o n o f t h e b la n k t e s t i s t h e s a me a s t h a t d e s c r i b e i n t h e me t h o d o f d e t e r min a t i o n b u t wi t h - o u t a d d i t io n o f s a mp le . 3 . 5 C a lc u la t

47、 i o n a n d e x p r e s s i o n o f t h e r e s u lt T h e c a lc u la t io n o f t h e c o n t e n t o f c a f f e in e i n t h e t e s t s a mp le i s c a r r ie d o u t b y L C d a t a p r o c e s s o r o r a c - c o r d in g t o t h e f o r mu la ( 1 ) , Th e b l a n k v a lu e s h o u ld b e s

48、 u b t r a c t e d f r o m t h e r e s u l t o f c a lc u la t io n . : A 。 c .。 V A今 八 ， .爪 . . . . . . ( 1 ) Wh e r e: X-t h e r e s id u e c o n t e n t o f c a f f e i n e i n t h e t e s t s a mp le, mg / k g; t h e p e a k a r e a o f c a f f e i n e i n t h e s a m p l e s o lu t io n , mm ;

49、t h e c o n c e n t r a t io n o f c a f f e i n e i n t h e s t a n d a r d wor k in g s o lu t io n, IAg / mL ; t h e p e a k a r e a o f c a f f e i n e i n t h e s t a n d a r d wo r k in g s o l u t i o n , mm Acs凡 V -t h e l a s t v o l u mn o f t h e s a mp le s o lu t i o n , mL ; m-t h e c o r r e s p o n d in g ma s s o f t h e s a mp l e in t h e f i n a l s a mp le s o l u t i o n , g . 4 L i mit o f d e t e r mi n a t io n a n d r e c o v e r y 4 . 1 L imi t o f d e t e r mi n a t i o n T h e l imi t o f d e t e r mi n a t io n o f t h i s me t h o