1、糖尿病周围神经病变患者血清心磷脂酰基转移酶1及髓鞘碱性蛋白的检测及临床意义研究摘要目的：通过测定血清衡鞘碱性蛋白(MBP)、心磷脂酰基转移酸I(A1.CAT1.)在正常人、单纯糖尿病患者、糖尿病合并周用神经病变患名血清中的含量,以分析MBP以及A1.CAT1.与糖尿病周围神经病变的关系,从而进一步探讨血清MBP、A1.CAT1.与糖尿病周围神经病变发生发展中的意义。方法I选取2017年3月1日至20”年10月31日在解放军兰州总医院内分访科住院治疗，并符合纳入、排除标准的2型糖尿病患者共109例，根据有无神经病变分为中纯糖尿病组54例(DM组，男28例，女26例)，合并周围神经病变患者55例(
2、DPN级,男26例，女29例)，另选取同时期我院体检中心健康体检者50例(NC组，男24例，女26例为正常对照组作为研究对象。记录入选对象的基本信息，测星:身高、体重，计算BM1：采集静脉血，测定空腹血犍(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1.c)s超氧化物岐化拗(SOD),高密度脂蛋白(HD1.-C),低密度脂蛋白(1.D1.CC总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG),血尿酸(UA)、血清胱抑素-C(CYS-C).采用酹联免疫吸附反应(E1.1.SA)法测定血清中A1.CATI、MBP的含量，应用SPSS20Q统计软件对数据进行分析，以PV0.05为差异有统计学意义。结果：I、DM组、DPN组血清M
3、BP水平明显高于NC组(2.I3O.69Ugf1.1.vs2.640.97ug/1.vs2.94I.O4ug1.)(均P0,05);DM红、DPNA1.CATI水平明显高于NC组(I()49.81!135.57pgn1.vs1109.75pgm1.134.10vsII66.51I5I.5Ipgm1.),差异有统计学意义(均PVO.05)：DPN组血清MBP、A1.CAT1.水平明显高于DM组,差异有统计学意义(均PV0.05)；2、血清MBP水平与病程、HbA1.c、FPG呈正相关(r=0.267.r=O.271,r=0.340,均PV0.05)：血清A1.CATI与与病程、FPG、HbAk呈
4、正相关(r=0.270,r=O.221.r=O.I59,均P0.05):4、多因素1.ogistic回归分析显示:病程OR=I.324.95%C1.1.1761.489)、MBP(OR=1.708195%C1.1.0882.683)、A1.CATI(OR=I.004.95%C1.1.1.1.0()6)为DPN发牛的独立危险因素。结论：1、血清MB1、31.CATI在单纯糖尿病组、储尿病周困神经病变组均较正常对照组升商：血清MBP,A1.CATI在糖尿病周围神经病变组较单纯糖尿病组升高:2,糖尿病病程较长,血糖控制差的患者，血清MBP、A1.CAT1.均可出现升高：3、血清MBP、A1.aAT1
5、与可能参与了糖尿病周围神经病变的发生发展过程，或许可作为触尿病周围神经病变的预测因子。关键词；糖尿病:周闹神经病变：MBP；A1.CATI前言糖尿病(Diabctcsmc1.1.itus,DM)是以慢性血糖升高为主要特点的一组代谢性疾病。目前已被认为是世界性的重要公共卫生问题，近年来其发病率在全球范囹内迅速增长，来自国际糖尿病联盟(Internationa1.DiabcIcsFedcra1.ion.IDF)的资料显示：全球DM发病率总体呈上升趋势，预测到2035年，全球DM患者数是将达到5.92亿U1.在我国，DM的发病情况更为严重.2010年我国国家疾病控制中心及中华医学会内分泌学会，依据
6、WHO1990年的DM诊断标准对我国成人DM的患病情况进行调查，显示其患病率为9.7%,证实我国已经成为全球DM患病人数最多的国家.在DM发生发展的过程中，伴随多种并发的症状，如心脑血管、眼底、灯脏、周用神经、足等病变，严重还可导致患者致残甚至致死，不仅影响患者的生活质量，而且给家庭及社会带来了极贞的经济负担。在DM的所有悭性并发症中，糖尿病周困神经病变(Diabcticpcriphera1.curopaihy,DPN)是触DM最为常见的慢性并发症之一。国外有研究证实，因采用的诊断标准和方法的不同，约50%-90%的DM患者可伴发DPN,其中30%-40%的患者可无临床症状。甚至在有些还未确诊
7、的DM患音中，也已经出现不同程度的周国神经的病变网。在DPN起病时，患者通常无任何临床症状，而当患者出现明显的麻木,性痛、烧灼、发凉、蚁行感等神经症状时，DPN已经发展到不可逆的阶段。但关于DPN的诊断目前尚口没仃统的标准，临床主要依据患者的症状和神经系统检查。近年来多种检杳方法为DPN的筛查及诊断提供了新的思路，但其或因操作困难，或因价格昂贵,不易在临床广泛实施比兀由于早期诊既的困难,和神经病变晚期的不可逆性，绐患者及家庭带来了沉重的精神、经济负担。因此，寻找一种敬感性强、特异性高的DPN相关的检测指标，是目前国内外的研究热点。目前的研究证实DPN的主要病理改变是周围神经的脱髓鞘和（或）轴索
8、变性。其发病机制目前尚未完全阐明，已有的研究显示，DPN的发病机制主要在于网：多元醉途径、AGES增多、PKC激活、己糖胺通路、氧化应激等众多途径.在DPN诸多机制中，以“毓化应激”为中心的统一机制理论占有亚要地位，该理论认为：高血糖引起氧化应激是导致多种并发症的始动因素与中心环货,其他机制均为氧化应激的下游机制，而且在细胞实验中也证实，通过减轻氧化应激,可明显削弱其他通路的活性。氧化应激与DPN的发生发展有着密切的关系。髓鞘碱性蛋白（MyeIinbaSiCProtein.MBP）是神经髓鞘的重要组成之占髓鞘蛋白总量的1/3,周围神经的MBP由雪旺氏细胞合成、分泌，神经系统遭到各种破坏性病变累
9、及到他鞘时，其可糅放入血，其在血清中含量的增高与储鞘被破坏的程度相一致“叫因此我们推测，血清MBP水平与DPN相关，在血清中检测MBP的浓度可间接反映周用神经受损伤的程度。氧化应激主要在线粒体发生，线粒体的功能直接影响氧化应激的程度。心璘脂（CardiOIipin,C1.）位右线粒体内质网，在线粒体呼吸链电子传递，线粒体融合与分裂，细胞凋亡和线粒体自噬等方面起着重要作用，但其合成以后需要经历重构才能发挥上述功能1.A1.CATI（1.ysocardio1.ipinacy1.transferase1）是位于线粒体相关膜上的一种心磷脂酰基转移施，在氧化应激的情况下，A1.CATI可催化C1.病理性
10、重构，使线粒体功能障碍加重，导致氧化应激进一步加重U%故氧化应激影响/A1.CAT1.的表达，在血清中检测A1.CATI的浓度，提示了氧化应激的程度，可能间接反映DPN病变的程度。基于上述原因，本研究的目的在于通过分析单纯糖尿病患拧（DM组）、糖尿病周围神经病变患者（DPN组）、正常对照组（NC组）血清MBP、AI.CATI的变化，进一步探讨MBP、A1.CATI与糖尿病周围神经病变的关系，为临床诊断DpN提供定的理论依据。立题依据1.1目前国内外糖尿病流行病学调查随着经济发展和人们生活方式的改变，肥胖和超重比例增加，DM已经成为当前除心血管疾病、肿瘤之外的又一严亟危害人类健康的非传染性疾病(
11、noncommunicab1.cdiseases.NCD),21.2010年，世界范围内因DM引起的死亡人数高达130万口儿来自IDF资料显示,2013年全球DM患者高达3.82亿,而其中的80%来自于发展中IS家。我国作为最大的发展中国家，近年来，DM的发病情况更为严重，2(X)7至2008年全国14省市的流行病学调查结果显示，我国2()岁以上成年人患DM的概率为为9.7%,DM前期患病率为15.5%IM1.2010年采用美国糖尿病学会(AmericanDiabetesSociety.ADA)提出的，同时以糖化血红蛋白26.5%为诊断标准之一，则全国18岁以上成人的DM患病率高达116%,患
12、病人数约I亿左右，处于DM前期为50.1%U叫到2013年,我国成人DM患病率为10.9%,DM前期患病率为357%UKDM的防治工作已然成为我国重要的问题之一。DM的主要危害在于因长期高血犍及代谢紊乱引起的一系列慢性并发症的发生。如糖尿病周围神经病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、以及糖尿病大血管病变等。随着糖尿病患病人数的增加，糖尿病并发症的发病率也在逐年升高，但目前在中国，糖尿病并发症的防治形势并不乐观.1.1糖尿病周围神经病变研究现状12IDPN流行病学调查DPN作为DM患者最常见、最棘手的慢性并发症之一，其发生、发展与血糖的控制情况密切相关“工DM忠者一生中DPN发生率超过60%,其
13、中36%存在严重的难治性疼痛,DM患者出现DPN后,3年生存率约为53%1网。即便是初诊的糖尿病患者，有相当一部分已经存在周围神经病变，万慈U9等对新诊断677例2型糖尿病患者进行分析发现，其中DPN的患病率为39%。DPN可累及周围神经系统的任何部分，导致足部渍疡、坏疸，甚至械肢.据报导，糖尿病的截肢率约为26.4%,为非精尿病患者的15倍，也是目前非创伤性截肢的主要原因改ANDREW在2(X)8年欧洲糖尿病研究协会(EUrOPeanDiabetesResearchAssociation.EASD）年会报告中表示，全球每30秒便会发生1例因糖尿病而截肢的事件，其中百分之八十以上的事件是可以预
14、防的用）。DPN在糖尿病前期就可以发生，早期可无明显临床症状，如果门诊医生仅根据患者的症状来诊断，可能延迟DPN的早期诊断及早期干预治疗。因此，提高DPN的早期诊断率十分重要，寻找合理精确的筛查方法十分关键，尤其是对无症状DPN的早期筛查.1.2.2 DPN的定义、临床表现、分型DPN是指在排除其他病因的前提下，犍尿病患者出现的周围神经功能障碍相关的症状和（或体征。其临床表现主要取决于神经病变的类型以及受损的神经，临床症状主要表现为对称性的双恻肢体麻木、瘦痛、感觉异常或感觉丧失，如皮肽有蚁爬感、烧灼感、针剌样感觉，手脚自觉发凉，或电击样感觉。DPN主要分为6型阳：（1）远端对称性、多发性神经病
15、变，为最多见的类型；（2）近端运动神经病变，常表现为肌肉受累及：（3）局灶性单神经病变，可表现为单侧顿神经或脊神经受累及：（4）非对称性的多发局灶性神经病变，表现为同时多个单神经的神经病变：（5）多发神经根病变,最常见为腰段多发神经根病变：（6自主神经病变，可累及呼吸、消化、心血管、泌尿生殖系统，还可出现泌汗、体温调节功能障碍等。1.2.3 DPN的诊断对于DPN的诊断到目前为止国际上并无统一的标准，指南推荐主要通过评估临床症状和体征以及进行神经功能检查两个方面对DPN进行诊断。6中国糖尿病防治指南，2013版推荐的诊断标准包括有明确的糖尿病病史，有临床症状（疼笳、麻木、感觉异常等）者：5项检
16、查温度觉、针剌觉、压力觉、振动觉、踝反射）中任1项异常：无临床症者：5项检查中任2项异常，且排除其他病因（颈腰椎病变、药物尤其是化疗药物的神经毒性作用、脑梗死后遗症、格林-巴利综合征、肾功能不全体内蓄积的代谢毒物对神经的损伤、严重动静脉血管性病变等）引起的神经病变，临床可诊断为DPN.,另外DPN的诊断分层分为确诊、临床诊断、疑似和亚临床四个方面。目前临床医册多依据一些DPN临床评分系统对DPN的病变程度进行评估、量化。大多数学者认可的有以下两种评分系统|：，1：I.多伦多临床评分系统（TorontoC1.inica1.ScoringSystem,TCSS）：HITDPN的筛查及其严重程度的评
17、价。TCSS评分包括神经症状评分、神经反射评分及感觉功能检查评分3部分。国内有研究显示侬|,TCSS对DPN的诊断价值较高，其神经病变的分级对临床有应用价值。2.密歇根神经病变筛查系统g23(MiChiganDiabeticNeuropathySc1.1.1.mmo1.1.并且的机（餐后任何时间）血植或加上有尿病典里症状：空腹（禁热盘接入至少8小时7.0mmo1.1.血糖或加上无糖尿病典型症状：葡前精负荷后2小时血糖211.ImmoI/1.注：以上三条符合其中条均可诊断翻尿病:空腹状态指至少8小时没有摄取任何热量.2,DPN的诊断标准：参照2013版中华医学会糖尿病分会中国2型糖尿病防治指南提
18、出的域尿病周围神经病变的诊断标准（1）符合1999年WHO提出的糖尿病诊断标准；（2）在确诊糖尿病时或糖尿病之后出现神经病变：（3）临床症状和体征与DPN的表现相符：（4）有疼痛、麻木、感觉异常等神经症状，以卜F项检查中如果有两项或两项以上正常则可诊断为DPN：（温度觉异常：尼龙丝检查显示足部感觉减退或消失：振动觉异常：踝反射消失：NCV检杳显示有两项或者两项以上减慢）。（5）排除诊断：需排除其他病因引起的神经病变，如颈椎病变（神经极乐迫、椎管狭窄、颈腰椎退行性变）、中枢神经系统疾病、格林巴利综合征，除严重动睁脉血管性病变等，药物尤其是化疗药物引起的神经毒性作用以及肾功能不全引起的代谢毒物对神
19、经的损伤。如根据以上检查仍不能确诊，要进行鉴别诊断的患者，可行神经肌电图检杳。2.2.2排除标准1、其他内分泌疾病：如甲状腺疾病、肢端肥大症、肾上腺皮质功能紊乱等疾病：2、维发性糖尿病、糖尿病急性并发症（酮症酸中毒及育血糖高港状态）；3、除外高血压、心脏病，及肝肾功能异常者：4.处丁明显缺氧、应激状态者（如泮重感染、创伤、手术、心脑血管事件及肿瘤等消耗性疾病）：5、妊娠或哺乳期妇女：2.2.3正常对照组入选条件1、均来自同时期兰州总医院体检中心的健康体检人员：2.选取年龄、性别均与入选的糖尿病组及糖尿病周围神经病变组相近的人员；3、经实验室检查，空腹询葡糖VSImoV1.或OGrr实验中，2小
20、时血浆葡萄糖V7.8m11w1.1.,微化血红蛋白V6.5%,且无心、肝、肾功能异常：4、排除高血压、心脏病等慢性病，无其他内分泌疾病（肢端肥大症、甲状腺疾病、肾上腺皮质功能紊乱等疾病）；5、排除处于急性感染、外伤、肿瘤、疼痛等应激状态的患者；6、无精神心理障碍，无M酒、吸毒、滥用药物史：7、无糖尿病家族史.2.2.4分组根据2013年中华医学会犍尿病分会中国2型糖尿病防治指南提出的糖尿病周围神经病变的诊断标准将上述符合纳入、排除标准的109例住院2型糖尿病患者分组，其中单纯糖尿病组54例（DM组，男28例，女26例），合并周围神经病变患者55例（DPN组，男29例，女26例），同时期我院体检
21、中心健康体检者50例（Ne组，男24例，女26例）作为正常对照组。2.3研究方法1.1.1 者一般资料收集制定患者临床资料表格,详细记录患齐入院时的般资料,包括姓名、性别、年龄、病程、ID号、既往史、糖尿病家族史。受试者摘帽、脱鞋，垂直站立于身高体重测量仪上，使得枕部、愕部、足跟与垂直尺紧靠，记录研究对象的身高、体重，身高精确到O1.cm,体重精确到0.1kg,计算体重指数。注：体质量指数BMI)=体或(Kg)/身高2(m2)1.1.2 实设室资料收集所有受试对象测试前均空腹10-12小时，入院次日清晨静脉采血测定各项生化指标。W1.化血红蛋白(HbAIC)测定采用离子交换高液相法，空腹血浆仙
22、劭触(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TOs高密度脂蛋白(HD1.-Ox低密度脂蛋白(1.D1.-C),血尿酸(UA),超氧化物歧化陶(SoD)、胱抑素C(CYS-C)测定均采用日立自动化分析仪7600。以上所有实物室指标均由我院检验科所得。1.1.4 血清样本收集所有患者均保持原有饮食习惯，空腹10-12小时，入院后次日清晨在平静状态下抽取净脉血约4m1.,使用黄色一次性真空采血管盛装，静置常温下2小时，使用低温高速离心机于41C,转速设为3000转/分，离心20分钟，除去F层血细胞，分离出上层血清,用做好标记的EP管(200UI)分装，及时将分离好的血清标本整齐放W.于-80C冰箱保
23、存，保存过程中若出现沉淀再次离心，待所有标本收集完毕后统一检测MBP、A1.CATI浓度。1.1.5 主要实验材料实验材料公司人IM精域性蛋白试剂盒96T甘肃欣城生物科技有限公司人心磷脂微基转移柄1试剂盒96T甘肃欣城生物科技有限公司黄色一次性真空采血管山东奥奥特医疗器械有限公司一次性使用的脉血样采集针山东成武褰诺医疗器械仃限公司EPPendOrf离心管(EP)伤国艾本徵公司无筋移液头Axygen公11J滤纸Whatman公司236主要实验仪器设备实验设备公司超低温冰箱冷藏柜/低温冰箱水处理系统R1.O医用工作超净台电子分析天平AUW120D高压辘汽灭菌器GR60DR低温而速离心机5417R微
24、量移液器电热恒温水浴箱蛋白熊荡娠床特外线分光光度仪UV11青岛海尔集HI青岛海尔集团广州誉维生物科技有限公司上海一恒科学仪器公F日本Shimadzu公司荚国zeaIway公司镌国Eppendor公司的国Eppendor公F上海医疗器械七场褰默飞世尔科技公司上海美普达公司2.4 实验方法2.4.1 联免疫吸附试验（E1.ISA）测定鞘球性蛋白（MBP）1、将试剂盒从-20C冷藏环境中取出，放理医用工作超净台，室温下平衡约20分钟左右。2、标准品的稀释见下表：4000Pgjm1.5号标准品1.50u1.的原倍标准品加入ISoU1.的标准品输择液2000pg.,m1.4号标准品I5u1.的5号标准品
25、加入150u1.的标准晶稀和液100Opg.m1.3号标准品ISOU1.的4号标准品加入150u1.的标准品稀杼液SOOpgZmI2号标准处I5u1.的3号标准品加入150U1.的标准品稀棒液250gm1I号标准AAI5u1.的2号标准品加入I5u1.的标准品稀称液3、加样：首先设空白孔、标准孔、待测样品孔，空白孔作为对照不加样品和的标试剂，其余各步操作相同。按照标准品稀释顺序，在胸标包被板上标准品孔准确加样50u1.,待测样品孔中加入配餐好的样品稀择液40u1.,然后再加入待测血清样品10,样品最后稀释的倍数为5倍。加样时使用移液枪准确将样品加于施标板孔的底部，每次加入血清样品后弃去无前移液
26、头，换取新的移液头吸取下一个样品，吸取样品是避免吸入气泡，尽量不触及孔壁，轻轻晃动使其混匀，时间控制在5分钟以内。4、温白.：用1号封板膜封板，符加好样品的陶标包被板置于37C电热恒温水浴箱温育30分钟。5、配液：将30倍浓缩洗涤液缓慢倒入烧杯，用蒸幅水稀择3（）倍放置备用。6、洗涤：将包被板从37C电热恒温水浴箱取出，小心将封板膜揭掉，迅速翻转弃去液体，用力甩干，在事先准备好的滤纸上拍干，快速将包被板每孔加入洗涤液，放置震荡摇床30秒后，弃去洗涤液，操作时迅速翻转包被板将液体甩出，在漉纸上拍干，如此亚复操作5次。7、加酶:使用移液枪,每孔加入酶标试剂501.,空白孔除外。8、温育:再次用2号
27、封板膜封板,置于37C电热恒温水浴箱温育30分钟“9、洗涤：将包被板从37*C电热恒温水浴箱取出，小心将封板膜揭掉，迅速阚转弃去液体，用力甩干，在事先准备好的灌纸上拍干，快速将包被板每孔加入洗涤液，放巴震荡摇床30秒后，弃去洗涤液，操作时迅速翻转包被板将液体甩出，在滤纸上拍干，如此重其操作5次。10、显色：使用微疥移液器每孔先加入显色剂A501.再加入显色剂B501.轻轻麴荡混匀使反应充分，在37C电热恒温水浴箱避光显色10分钟。11、终止：使用微量移液冷将每孔加入终止液501.,终止反应。12、测定:加终止液后15分钟之内，以空白孔调零,紫外线分光光度仪45Onm波长依序测量各孔的吸光度（O
28、D值）。13、所有实验样品、无施移液头、涯纸,洗涤液、包被板和各种废弃物以污染物处理。14、绘出标准曲线，计算出标准曲线方程，将每个OD值分别代入方程计算对应的待测样品蛋白浓度。2.4.2 鼻联免疫吸附试验（E1.ISA）测定心磷腹酸基转移的1（A1.CAT1）1、将试剂盒从-20C冷藏环境中取出，放置医用工作超净台，室温下平衡约20分钟左右。2、标准品的稀稀与加样：首先设空白孔、标准孔、待测样品孔，空白孔作为对照不加样品和根标试剂，其余各步操作相同。按照标准品稀粹顺序，在前标包被板上标准品孔准确加样50u1.,待测样品孔中加入配置好的样品稀择液40u1.,然后再加入待测血清样品101.样品最
29、后稀择的倍数为5倍。加样时使用移液枪准确将样品加于配标板孔的底部，每次加入血清样品后弃去无筋移液头，换取新的移液头吸取卜一个样品，吸取样品是避免吸入气泡，尽量不触及孔壁，轻轻晃动使其混匀，时间控制在5分钟以内。（稀稀后各孔加样量均为5（）1.,浓度分别为1200pg/mh800pg/m1.,400pgm1.200pgn1.100pgm1.）。3、以卜操作步骤与上一试剂盒相同。2.5 统计学方法时临床所收集的病例资料及时建立相应数据库，进行数据管理，统计分析软件用SPSS20.0软件包。所有服从正态分布的数据用（均数土标准差）xs表示，非正态分布的资料经对数或者平方根转化后进行分析，计量资料比较
30、采用采用单因素的方差分析,两两比较采用1.SD法,分类资料比较采用卡方检验,血清MBP、A1.CATI与其他因素的相关性分析采用Spcamwn相关分析，影响因素的确认采用多因素1.OgistiC回归分析，以P005）.表1NC组、DM组、DPN组一般资料比较（xs）IS床参数NC组(n=50DM组66.567.8465.518.656S.148.720.3930.675BMI(kgm221.772.2822.541.6622.182.011.9S90.144性别（男/女）24/2626/2829/260.2610.878注：年龄、病程、身高、体重、BM1.采用方差分折，性别比较枭用R方检验，的
31、两比较用1.SD法,以P（）.05为差异有统计学意义.3.2 三组临床指标比较由表2可见，与对照组比较.DPN组、DM组在病程融化血红蛋白(HbA1.c)、空腹血筋(FPGk高密度脂蛋白(HD1.C)、胱抑素(CYS-C)均明显升高,存在统计学差异(PVO.05),与对照组比较，DPN组、DM组超氧化物岐化的(SOD)水平明显降低P0.05).表2NC组、DM组、DPN组各临床指标比较(xs)够床参数NC组(n=SODM组(n=54DPN组(=55)FP病程(年)0.0020.0073813.1(T8.9513.40b162.50.001HbA1.c(%)4.7811.239.481.40j9.031.72j199.3780.1.FPG5.221O.348.6311.71j8.98t1.97a93.4760.001TC(mmo1.1.)4.3710.814.57*1.02432*0.961.0410.356TG(mmo1.1.)2.O4O.362.130.672.181.000.S090.602HD1.-C(mmo1.1.)1.32O.311.2O1O.2Oj1.060.22at,13.770mo1.1.)2.3310.442.60i0.66i2.520.742.5270.083CYS-C(mg1.)0.5910.110.680.2,0.7610.22h10.9530.001U
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