降钙素基因相关肽对重症中暑大鼠脑细胞凋亡的作用研究.docx

1、降钙素基因相关肽对重症中暑大鼠脑细胞凋亡的作用研究邱婷I刘志峰2,陆程翔3(厦门大学附属中山医院神经内科1、重症医学科2,福建厦门361004；南部战区总医院重症医学科3，广东广州510010)通讯作者：陆程翔，Email：摘要目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对重症中暑大鼠脑细胞凋亡的影响。方法应用可调节人工气候舱进行大鼠重症中暑模型的建立。分为对照组、热打击组(HS组)、热打击+注射CGRP组(HS+CGRP组)、热打击+注射CGRP8-37组(HS+CGRP8-37组)，各5只。在热打击后HS+CGRP组大鼠均立即经颈动脉注射CGRP,在HS+CGRP8-37组大鼠均立即经颈动脉注射C

2、GRP8-37。所有大鼠于造模2小时后取脑组织进行细胞凋亡、CaSPaSe-3、BeI-2检测。结果与HS组比较，在HS+CGRP组脑细胞凋亡水平明显减少(11.675.65VS4.001.96,P0.05),而在HS+CGRP8-37组则有显著增加(11.675.65VS18.673.67,P0.05),差异均有统计学意义。与HS组比较，在HS+CGRP组脑组织活化caspase-3蛋白水平明显减少(0.590.12VS0.410.09,P0.05),而在HS+CGRP8-37组则有显著增加(0.590.12VS0.790.10,P0.05),差异均有统计学意义。HS组Bcl-2蛋白表达水平

3、较对照组出现明显下降(2.150.74VS0.820.57,P0.05),在注射CGRP后，Bcl-2蛋白水平较HS组显著增加(0.820.57VS2.010.73,P0.05),差异均有统计学意义。结论CGRP对重症中暑大鼠脑细胞凋亡有抑制作用。我键词重症中暑；降钙素基因相关肽；脑；凋亡；Caspase-3；Bcl-2rhestudyontheeffectofcalcitoningene-relatedpeptideonapoptosisofbraincellsinheatstrokerats.QIUTing1,LIUZhifeng2,LUChengxiangNeurologicalDepa

4、rtment1,IntensiveCareUnit2,ZhongshanHospitalXiamenUniversity,Xiamen361004,China;IntensiveCareUnit3,GeneralHospitalofSouthernMilitaryCommand,Guangzhou510010,China.AbstractObjectiveTbinvestigatetheeffectofcalcitoningene-relatedpeptide(CGRP)onapoptosisofbraincellsinsevereheatstrokerats.MethodsThemodelo

5、fheatstrokeinratswasestablishedbyusingadjustableartificialclimatechamberRatswererandomlydividedintofourgroupsof5animalseach:Controlgroup;HSgroup,heatstroke;HS+CGRPgroup,heatstrokeandinjectionofCGRP;HS+CGRP8-37group,healstrokeandinjectionofCGRP8-37.EachratintheHS+CGRPgroupreceivedabolusinjectionofCGR

6、Pthroughcarotidarterytrocarafterheatstress.IntheHS+CGRP8-37group,eachratreceivedabolusinjectionofCGRP8-37afterheatstress.Thebraintissuesoftheratsweretakenforapoptosis,caspase-3andBcl-2detection.ResultsComparedwithHSgroup,thelevelofapoptosisinHS+CGRPgroupwassignificantlydecreased(11.675.65VS4.001.96,

7、P0.05),whileitwassignificantlyincreasedinHS+CGRP8-37group(11.675.65VS18.673.67,P0.05).Thedifferenceswerestatisticallysignificant.ComparedwithHSgroup,theexpressionofcaspase-3proteininHS+CGRPgroupwassignificantlydecreased(0.590.12VS0.410.09,P0.05),whileitwassignificantlyincreasedinHS+CGRP8-37group(0.5

8、90.12VS0.790.10,P0.05).Thedifferenceswerestatisticallysignificant.TheexpressionlevelofBcl-2proteininHSgroupwassignificantlylowerthanthatincontrolgroup(2.15土0.74vs0.820.57,P0.05).AfterinjectionofCGRP,theexpressionlevelofBcl-2proteininHSgroupwassignificantlyhigherthanthatinHSgroup(0.820.57vs2.010.73,P

9、0.05).ConclusionCGRPcaninhibittheapoptosisofbraincellsinsevereheatstrokerats.KeywordsHeatstroke；CGRP：Brain；Apoptosis；Caspase-3;Bcl-2重症中暑是以体温迅速升高和中枢神经系统损害为特征的致死性紧急状态。脑损伤是其常表现，具有很高的发生率，仅次于多器官功能障碍5%其机制复杂，已有研究显示，脑细胞凋亡是其重要机制之一。降钙素基因相关肽(CGRP)是一种通过基因技术新近发现的内源性神经肽。它不仅在血管舒张及神经传导中扮演重要角色，对于脑损伤的发生、发展也有紧密的关联凡，研究

10、表明，CGRP能显著增加缺血性病损伤的脑血流，并能减少其缺血性神经细胞损伤。在烫伤、寒冷、紫外线照射、水浸等刺激后，CGRP的表达也有明显的增加间。因此，本研究假设CGRP对于重症中暑所致的脑细胞凋亡损伤也有保护作用。然而，目前为止，相关研究甚少。本研究旨在通过构建重症中暑模型来探讨CGRP对于重症中暑脑细胞凋亡的作用。1材料和方法1.1 动物健康成年雄性WiStar大鼠20只，体重200-230g,置于常温环境(12小时光照，室温25.00.5,湿度355%)且能自由饮水。1.2 模型制备及干预20只大鼠饲养于室温25.00.5,湿度355%的常温环境，随机分为4组(n=5)：对照组、热打击

11、组(HS组)、热打击+注射CGRP组(HS+CGRP组)、热打击+注射CGRP8-37组(HS+CGRP8-37组)。造模前大鼠均腹膜腔注射戊巴比妥钠(50mgkg)麻醉。所有大鼠均于热打击前插入套管针至颈动脉备用(24g)o对照组维持在常温环境。实验组均放入人工热气候模拟舱，舱内控制干球温度(36.50.5),湿度(605)%用肛温表持续监测肛温。当肛温达到41.0中止热打击。HS+CGRP组大鼠复温后经颈动脉注射CGRP(2ugml,0.5ml)；HS+CGRP8-37组大鼠复温后经颈动脉注射CGRP8-37(30nmolkg,0.5ml)。HS组、对照组仅注射等量生理盐水。1.3脑组织采

12、集及处理1.3.1脑组织采集各组大鼠于造模后2小时行麻醉后立即解剖取脑。大鼠脑浸入10%中性甲醛溶液内固定并行TUNEL检测。脑组织切片(3m)行蛋白免疫印迹检测。1. 3.2TUNEL检测切片常规脱蜡，梯度乙醇水化，PBS漂洗；将切片浸入新鲜配制的映H。，室温封闭20分钟，PBS漂洗；之后将切片浸入0.1%Triton-100通透液中，室温促渗，PBS漂洗；依次加入TUNEL混合工作液反应。然后再加DAB工作液，室温显色反应，PBS漂洗；用苏木素复染、封片，光学显微镜下观察拍照。每张切片选3个高倍视野，计数每个高倍视野TUNEL阳性细胞数，取其平均值。L3.3蛋白免疫印迹检测脑组织块以裂解液

13、进行裂解。用BCA法测定蛋白质含量。之后稀释样本至2gulo取40Hg样品行SDS-PAGE电泳。用湿转法将凝胶上蛋白样品转印到PvDF膜上并加入兔一抗封闭过夜。次日5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，羊抗兔IgG(H+DHRP反应。实验中以-actin作为内参照。继以ECL反应后显影、定影。用QuantityOne软件进行定量测定(v4.62版本)。结果以待测蛋白与内参照B-肌动蛋白(B-actin)的灰度值比值表示。1.4统计学分析所有计量资料均采用均数土标准差(s)表示。数据统计均采用SPSS19.0软件处理。多组间比较采用单因素方差分析及Dunnett,ST3法。以P0.05认为差异有统计

14、学意义。2结果2.1 TuNEL检测大鼠脑细胞凋亡如图1、表1所示,与对照组比较,热打击后显著增加神经细胞凋亡(P0.05)o注射CGRP可以明显抑制热打击诱导的神经细胞凋亡。与HS组比较，在HS+CGRP组见凋亡细胞明显减少(11.675.65VS4.001.96,P0.05),差异有统计学意义。相反的，注射CGRP8-37则增加了热打击诱导的神经细胞凋亡。与HS组比较，在HS+CGRP8-37组凋亡细胞明显增加(IL675.65VS18.673.67,P0.05),差异有统计学意义。A.对照组；B.HS组；C.HS+CGRP组；D.HS+CGRP8-37组。2.2 各组大鼠活化CaSPaS

15、e-3蛋白水平检测蛋白免疫印迹检测显示脑细胞caspase-3蛋白水平在HS组较对照组明显增高(P0.05)注射CGRP可以明显抑制CaSPaSe-3蛋白水平的增高。与HS组比较，HS+CGRP组CaSPaSe-3蛋白水平明显降低(0.590.12VS0.410.09,P0.05),差异有统计学意义。而在HS+CGRP8-37组，caspase-3蛋白水平与HS组比较则有明显增高(0.590.12VS0.790.10,P0.05),差异有统计学意义。见图2、表1。Control HS HS+CGRP8-37 HS+CGRPActive caspase-3-actin图2Westernblot检

16、测各组大鼠脑组织caspase-3蛋白表达水平2.3 各组大鼠B&2水平检测接受热打击后，Bcl-2蛋白表达水平出现明显下降，HS组与对照组比较差异有统计学意义（P0.05）.注射CGRP后，Bcl-2蛋白水平较HS组显著增加，接近于对照组水平，HS+CGRP组与HS组比较，差异有统计学意义（P0.05）注射CGRP8-37后，Bcl-2显著下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P0.05）.见图3,表1。ControlHSHS+CGRP8-37HS+CGRP*I*Bcl-2WP-actin图3Westernblot检测各组大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达水平表1各组大鼠脑细胞凋亡指标的比较（元s

17、n=5）TUNEL阳性细胞数caspase-3Bcl-2对照组2.001.000.230.042.15+0.74HS组11.67+5.65*0.590.12*0.820.57*HSCGRP组4.00+1.96#0.410.09#2.01+0.73#HS+CGRP8-37组18.67+3.67#0.790.10#0.570.24*F值23.15832.3878.993P值0.0000.0000.001注：与对照组比较，*P0,05,与HS组比较，#P0.05o3讨论根据其病理生理反应，重症中暑被定义为与系统性炎症反应及诱发多器官功能障碍相关的高热状态。其中中枢神经系统损害尤其明显”。当热负荷持

18、续存在时，热损伤将会进展。其症状可从轻症的热惊厥到重症的死亡。对中枢神经系统的病理变化的认识对于重症中暑机制的理解十分必要。然而，目前相关资料甚少。BOUChama等证实热打击后脑内出现了包括脑细胞凋亡增加等不同情况的损害。在热打击的鼠模型中，甚至在体温39度时即出现了明显的脑细胞凋亡等损害，而随着温度的上升这种损害进一步加重，即使复温处理也不能阻止。然而，这种损害的机制仍不清楚。临床上还缺乏有效的方法来阻止这种脑损伤。CGRP是新近发现的内源性神经肽，其在神经系统内分布广泛，并且被认为在脑梗塞、蛛网膜下腔出血、脑创伤以及脓毒症等多种类型的中枢神经系统损害中有保护性作用田。因此，本研究对这一潜

19、在保护性因素进行了探讨。临床及实验室研究证实神经细胞凋亡是引起各种类型脑损伤的重要原因。凋亡有双面效应：它能清除老化细胞而发挥保护作用，而过度的凋亡则导致大量神经细胞丧失而损害神经功能，引起继发性损害。随着对重症中暑机制的持续深入理解，越来越多的研究表明热打击也能诱导脑神经细胞凋亡必。CGRP对热打击所致脑细胞凋亡的作用尚未得到证实。因此，本研究检测了大鼠的神经细胞凋亡。结果显示，热打击诱发的细胞凋亡被CGRP明显的削弱。相反的，CGRP8-37则增加了细胞凋亡（CGRP8-37为CGRP8特异性拮抗剂可以推测CGRP在热打击中能抑制神经细胞的凋亡。已知CGRP是通过激活G蛋白偶联受体进行信号

20、转导的。其激活可导致细胞内CAMP增高并进一步改变包括凋亡在内的细胞功能。CaSPaSe-3蛋白在凋亡中起着关键性作用。它是凋亡最常见的下游调控因素”8咒相关研究显示，CGRP在心脏、脑、胃肠道缺血再灌注损伤中的细胞保护作用是通过下调CaSPaSe-3来实现的2”。本研究探讨了相关的分子机制。检验了在热打击后CGRP是否能调节CaSPaSe-3蛋白水平。结果显示，注射CGRP在热打击后能显著降低caspase-3蛋白水平，而注射CGRP8-37则相反。这提示CGRP能通过干预CaSPaSe-3发挥对凋亡的抑制作用。这个结果与既往研究结果相近。然而，仍然不清楚下调caspase-3的是哪个上游信

21、号，这需要进一步的研究。已知Bcl-2是调节凋亡过程的基因家族的基本成员之一，能够通过调节CaSPaSe-3活性来发挥作用。因此，在检测CaSPaSe-3活性的同时，进行Bcl-2的检测，可以进一步佐证脑组织凋亡的变化情况。在本研究中，注射CGRP后，脑组织Bcl-2出现了明显的增高，更加说明了CGRP对脑组织凋亡的抑制作用的存在。总的本说，本研究表明CGRP对于重症中暑脑细胞凋亡有抑制作用。而且证实其机制包括通过下调caspase-3来抑制细胞凋亡。本研究对CGRP在重症中暑中的作用提出了新的看法，但是对于重症中暑脑损害的检测只局限于单一时间点,缺乏更长期的观察。因此，需要更进一步的研究来探

22、讨以对临床应用提供依据。参考文献1BROWNLOWMA,DARTAJ,JEFFCOTTLB.Exertionalheatillness:AreviewofthesyndromeaffectingracingThoroughbredsinhotandhumidclimatesJ.AustVetJ,2016,94(7):240-247.YEN,YUT,GUOH,etal.IntestinalInjuryinHeatStrokeJ.JEmergMed,2019,57(6):791-797.3 BOUCHAMAa,ROBERTSG,ALMohannaF,etal.Infammatory,hemosta

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