白鲜内生菌产生有效成分的能力.docx

1、白鲜内生菌产生有效成分的能力前言W.全株“将殊的忸做性气味，为多邠生点机帕统以干俅根皮入M,中药名为门鲜皮.真牙清热燥湿往华止料以及解冷等电安药理作用，用以治疗的水淋漓，湿存，黄泌乐赤，|门鲜的主要化学成分包括生物减类、拧愫苫4类、册体类.存亚索及费用类.挥发油臭、,fttt(U1.:中国Z比202m白鳏粗多傅，fKTMtrtV：c以RMHMtftW亢as(U7)1M!MnW.WMHtt.Hft及夫公.平境1提笠活性物质.I以及木豆的内生等具有跟好的抗化活根我国等研允人员在4种先国的药用tfi用中分阳的内生曲也R有杭瘠以及抗像的正悄.内生阿生州产生-系列具/MkM1.：H*,SftM,1.AH

2、IR他七分离奖定“什内比白倩的分离生亢偏冷分寅落定除!R第内生偏分离笠定以取代串AWUMwnnf1.ftf1.tit(U1.O)：RohrtuCrr.ctc*11or*4kindandprecursord1.r*opndd.ISPfoKEtr,eMopc幻c040biedfromDWWrhmDnectartktVEHofMAmooQ付Mu“mb)Mgh1.&Amftft(U1.1.):IntiiroenhmdMitrbm4nd11bcMdmenr,ximcWrcooow,oierajopIuysoaaocpe313W3M*1.)M3Stft(U12:(11MneKtMttw*w1.cdIbMm

3、cdicha1.(4m)u方生物活性的的次生代谢产物，并能够产生与空主植物相同或相似的药用活性的成分，I内生不仅是潜在的抗辄化剖资源史有良好的开发应用前景和就要的医药应用潜力。1.一AtWE1.Ii-HMn*FF101E白鲜药材以根皮入药不仅生.K年限长.而且我接我坏柿楂.而HH前对于白蟒的研究上要如ddM(*集中在化学成分、药理活性等方面.时药用活性成分单体的制番研究较少.所分腐都到的具石药用价位的门好化学成分花门鲜M出粉中含R低.并H结构更杂,化学合成至今做未成功.只候通过从白鲜等药用小拗的根茎.叶中提取，但其效率低,成本而限制了对于白鲜化学成分的深入研完和应用对于臼蚱化学成分的提取,若采

4、用传统的化学方法，其刷产物多，而H杏及对环境造成河染.对费源造成浪费.相反内生弧的象箱周期如.对环境要求比植物整低的多并且可以大批珞养.井H内生菌具仃很好的应用前冢.本试验格计时臼解内生苗的是否有生物活性进行研究，研究站!R将用明白鲜内生菌中是否有白鲜破、杨雳以及黄柏阳殍活性成分成衣合成其仃效成分的前提均版.AS少门鲜好生资源消耗.为我国的中药,医药保牝心等行业提供优质的原料I为可以快速大过得到白静碱、移用以及黄柏倒提供实收材料知理论侬据.I材料与方法1.1 材料1.1.1 1.1.供试材料白鲜桢保来却1.1.2 熔如烫IIHHI1%bkICie1.iiirrmMim成分W3勺簿跛鞘格。里PD

5、A)HW2J.g.WH3.雳懦水1.CmJ外半球联辂并祝INA)鬣臼腮IO.NQSa牛肉自粕3和：15.彩馅水100Dm1.K加总1雄界亚福从货门卷5和KHiPO.IJ,曲SgTHQ1.a笥内循10小显将JKO1.6加收虹0033g.地师I85g.薮馅水IODOinI麦芽初育培办N穆麦不没再在薪情水中充分洛解.ifiiia.调至pH=41Q分装,1.21.VXiISmin我氏粒断珞并基M,VU*If；V徐MeH照薄层色谭法中国为小2010年版部附录V1.B)试验,吸取上述港液答5M1.分别点于RG带层板上,以石油Ie-乙酸乙酩(7:3)为网开剂.怅开.取出.踪干f1.101.乙酣，在IoSU加

6、热至理点显色消斫；再由磷化铅钾溶液至斑点显色击fi.1.62 石油*乙乙(10:6)限薄层色设法(中国药典2010年版部附录V1.B)试验,分别吸取上述溶液85W”分别点于同一硅皎G薄层板上，以石油施尚酸乙ifi(10:6)为屣开剂，展开，取出，K,用Ig磕假乙肝必色,UOC供至加点显色清晰，再晞碘化阚？溶液至座点显色渊j.I/W0WH.-.臼付皮itt1.63 石*乙乙(1:1)/MkmeewajftKa.km0w何大学&街开StH中心.广810405)ME1.Uin*!1.t!fn!.Vd1.2015牌对照品和马材以及提取液口与-哦硅放G傅层板,展开条件石油雁(60DOU):乙酸乙用(1:

7、1);显色剂:365nn波长处观察关光斑点;能吞草倏浓俄检呼客显色.】050热网吹至弱点是色清晰.I1.6.4甲紫-甲-”(10:0.5：ai)懈薄层色谓法(中W药典刈。”版MIWVB)试蕤,吸取各种溶液51.分切点FR-硅胶GJm薄层较上，以甲末-甲静.冰窗酸(KM)$:0.”为展开剂，上行展开8Sb,取出.Ie干,喷10%的碇强乙醉的液,WUoS1.C烤粕中加慈3min,于365rnn条外灯F观能再喷10%硫酸乙酹.加热至段点显色清晰I用化饱钾溶液至斑点显色清麻1.65甲单环己建乙乙(3:3:3)年用薄层色设法(中国药典刘。年版部附录V1.B)试聚.用定性Ea1.代适敬吸取hi供试品溶液、

8、对照跖材溶液、对照片溶液点与同硅胶G薄层板J展开条件为甲尔环己炕.乙敌乙南(3:3:3)展开，取出，I府I.Zrf紫外365nm)卜也察荧光.蝌;咬以5、香草作St酸试液.(f.105T加拄至如点显色清晰.再够碘化彩伸溶液至斑点显色消晰.供试师色谱中.,色M用底的史置上,能相同傲色的斑点.检测提取液内仃尤口舒时.黄柏IH以及移胴JKU1.阵中UHAmoIig中&饮片1.6 株初母1.6.1 .ItNTMHI对上逑褥到的或商用打孔蹲取】5个曲僻，荫尊而朝下，可五个两柄放于一个PDA培养用中培养7-10天待其偷蛉长洪培笄I1.T时,创取值纥于淀纸上？I于28-30掇氏度的烘箱中H1.24小时,将干

9、燥后的微蛙置于2m1.离心管中.加入甲呼1.5m1.超声被提取40r.2h),超声后于痛心机6000r、7min*将上层液体用移液怆转移至新的飕心帝中作为供试品沼液.1.62IB层色,法母论施采川薄层色调法(中出药也2010年版部附录叫B)试龄.一定性毛编管适It吸取上述供试品溶液、对殖筠材溶液，对解品溶液点与同口胶G薄层板匕底开条件为甲笨环己烷乙酸乙南(3:3:3)展开，取出，晾干，Zt紫外36SnE)下以察荧光，燃后喷以5、杏率嵌硫敌试液，在IOS1.C加热至斑点显色沽新，再映碘化能划溶淞至斑点显色消蜥，供试品色谱中.在&对解&色诏相应的位置上.显相同颔色的加点.检测提取液内有无白舒即、黄

10、柏阳以及格胴.1.6.3 Im姑果取计跳各对照丛的Rfift,以及我光创点颜色，选取并记录RFtf1.I(U(0,1.的供试出港液号码。1.7 株复舜首先对1.3中JS选得到的的憔取新培笄，在康仃培养她上取5个的柄,分别培养在5个培笄11中.培养时间在2周左右.待B1.M长黄焙齐基石刮取|拄.合并于澄纸上.W-J-28-3oa氏度的供箱中燥24h.将干焕后的甫丝世于2m1.点心汗中.加入甲醉15m1.超质波槌取(40C.3h),担声后于悉心机离心6000r7m1,用移液枪取上层液体于断的隔心付中.1.7.23层色法整定内生活性就!1.7.2.1 石油乙乙(10:6)的薄层色谓法(中国药典3)1

11、04：版一部附录V1.B)wj.分1吸取I:述溶液.分别点于同一硅皎G薄层板上，以石油i-乙酸乙湎(10:6)为展开剂，展开，取出，取干，用10%碗酸乙静晶色1.QC烘至风点显色消新；再不碘化怀告浴情至斑点显色消阴，1.7.22甲荤-甲-冰(10:0.5:0.1)照一层色诺法(中国为其2010年版部附录WB)试验,啜取各种溶液51.分别点干同一豉脱GF&薄层板上.以甲料甲醇冰年酸(“hOS。”为展开剂.上行展开85on.取Hi.敢干，喷10%的碗酸乙的溶液，汽105亡烤箱中加热3111淅于365nm紫外灯下观察；内10%硫酸乙静，加热至9点区色消断I0蟆化强钾溶液至斑点显色清晰RFifi计算分

12、析.对比RFtfi.计算与分析RFfi.进一步蝴小范R1.并观察其黄光理点的取理性.Mk(mnr)HH%11M(CfiMMMMf11WN忡，量朱利依.if1.构件及(1.1.8商效液相色谱检，州中ce.itJ0Mhx-)z2律培城巾大彳生种化7家.冷於八段即)利用品效液相色谱法*JjR现性好以及KK位准确的防株提取液进行检特色谱条件色谱柱；A1.1.tinaC18(4.6w25Om.5um):保护柱：A1.1.-GuardTMC18(4.611n7.5ra.5un)：能动相：乙Iw0.1W(40:603:57.015(nin:43:5750:50.1520nin;SO:SO54:46.20-3

13、5nin).潦速1.0n1.nin.进样BtIO1.i1.柱if1.25V;检测波长238m在上逑条件下,白解碱黄柏制和棒阳的保留时间分别为15.6min,27.7min31.0nin对照出溶液的制备1密称取自鲜1对RRIa20ngRIOn1.U&中,加7。、乙髀至刻It1.忧勾.即解白Mt储谷液(200n%/1.);精密称取黄柏IW对照品4.0hrH5Ii1.杂版中.加70乙醉至刻度.推匀.即存黄柏阳储备液(SOOmi/1.):精密移取杨胴对照品2.0n110d.fi瓶中，U1.70%乙醉至刻发，捡匀，即为楞雳储备液(XXtagA)分别精定Iit双上述三舍此备液0.1M.2.6n1.,1.6

14、B1.JtSm1.JIt就中,加70乙肿稀ff至刻度，插匀，即得混合对照丛储液，一中白静碱黄柏阳和梓用的加业浓度分别为16ng/1.tOOnU64111.W)格Ift取上述混合对解占储备液50uI.直M1.球瓶中.如7伙乙醇稀MJg刻度.插勺即称混合对照鼻溶液.其中自鲜但黄柏曲(11楞超的质fit浓度分别为0.8nRy|201/I.X2111.1.9首体物对株产生白鲜*、黄柏及桂的影对含有有效成分的断株进一步处理.2结果与分析2.1 白鲜内生多样性分析本试验以3个不同地X的白鲜药材为样拈进行内生曲的分曲,共褥到楂内生W其中细窗有楂,占总分离比例的我府共有楂.占总分离比例的%.通过对白鲜的根皮、

15、叶片和木心内生阳的统计和分析.发现根皮内生他含最为I京,共分肉得到株内生菌.由总分离比例的%.其中也括株内生其菌和株内生细菌各占总分需比例的%fi%；叶片内生苗的含信显需饪于根皮，共分离得到株内生薄，占总分离比例的%,其中包括株内生。的和株内生细僧,各占总分离比例的%和%从木心分岗如到梅内生慎,占忌分成比例的%.包括株内生。的和憔内生细的，各占总分阖比例的%和%,内生位含减以低.2.2 厚层色谱法展开条件的选界2.2.1 2.1石油乙乙(7:3)照片及分析22.2石油-乙乙(10:6)照片及分析223石油-乙乙(1:1)照片及分析2.2.4 甲基-甲*(10:0.5：ai)照片及分析2.2.6

16、 甲荤孙己健乙乙(3:3:3)照片及分析2.2 对白鲜内生首是否产生活性成分初箫在株内生菌中箭透的到株内生菌存与白鄙药材相同或相似的物货.提取伤照片一张初痛的服片mB1.2W3ffi4W5ff1.6ff1.7统计上述,其卷到有相近Rf值的1铢总数为84阳榜号码分别为:6、1。,13、14、15、16、17,19.20、21、23、21、25、27、29、30、32、S3、34、35、呢、笛、39、40、42、41、43、44、45.46、47、49、50、60、6U68、7k9k100、IO1.外、103、105、】明、121、M5、】6撤、“强、18撮内、7电、】2、】8、28、38胞子、5

17、1、59、62、65、72、77.M1.,92.97、IOfk10孟、110、】9、116、122、138、110,143、146.147施子、148.149,150.151.153.155.156、158.159、164.165、167.174白鲜碱在行侬酹i色剂中不显色,黄光卜显钛色黄光段点,在淡化铅钾后始椎红色烦点.0亢？点心.，色剂储在会外资件卜猊察.1以发现黄柏网与蟀m的黄光Hr川;F颜色加深.在此/开条件下白鲜蜒、加柏鬲、杨用点在一个位置I：是可以得到较好的分国，菌株得到的荧光斑点较羽，应该是因为提取浓浓收旺，2.3 株复库红箭条件一2.4 育效液相色谱法窝菌株与单体的峰值.吸收度图片