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1、微生物过量合成丙酮酸 及代谢网络分析,凄图菊衅哺储作挂淋碉钉叛世蓝找稀枚汰疹艘谓宛急俩碌筛九脱刀桑底烈例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,研究背景,为什么要研究发酵法生产丙酮酸?,本研究的立题意义何在?,关于丙酮酸的生物合成，国外的研究进展如何?,浴纵九喧职秤罗高蜕收崖亭驮脓馅财蒲侩治敖汹颗铸距骄鞭揽墩蝴枕焰仿例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,丙酮酸是糖代谢中最重要的中间产物。,它位于合成代谢与分解代谢的转折点，在生物能量代谢中具有十分重要的作用。,在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。, 为什么要对发酵法生产 丙酮酸进行研究?,哀臂尾
2、吩佩粮银齿甜落钠怠齿纠唁闹铀栋经剐盯毗脱虎敏兆埔再栅奴旭添例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,丙酮酸的主要用途,瘁柱喝谭亮痛卓宠夫吞瞧锥绢宁撇篓立缓叭丽汝恭蛆趋颖牲奏吴体剖鱼朔例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究, 丙酮酸的化学法生产工艺,酒石酸脱水脱羧法目前用的主要生产方法：将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220 下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。 其主要缺点是 (1) 丙酮酸产率较低(对酒石酸质量产率为0.290.30 g/g)； (2)得到1 g丙酮酸需要消耗5 g硫酸氢钾 以目前酒石酸(1.5 万元/t)和硫酸氢钾(0.6 万元/t)的市场价格计算，
3、仅原料成本就至少需要8 万元/t导致丙酮酸的价格居高不下。,舆嘻察烷骂异饿嗜官磁莆冲关萍邀磅待拂囤舀榴谋尹抨朝芳墙是钎烫顾韵例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究, 丙酮酸的发酵法生产,发酵法生产丙酮酸在成本上具有明显优势。,问题是丙酮酸高产菌株的选育非常困难。,日本已经实现了发酵法丙酮酸的工业化生产，但在我国，尚未见到任何专利或研究报告。,喧滩湾管停帚嘱液碴羔武检艰浆悠妖闸决豪擦哉浦近拎匪浪苟通甚尹楷屠例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,酵母直接发酵法生产丙酮酸, 国外研究水平,细菌或放线菌直接发酵法生产丙酮酸,休止细胞法生产丙酮酸,完整细胞(或酶法)生产丙酮
4、酸,符晰批揍婉洗舵铝歼帐啄豌患耗篓株逊磕肝刀锣膛裂睁烈叔芳诫功史僳恨例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,酵母直接发酵法生产丙酮酸,丙酮酸脱羧酶(PDC) 转氨酶(PT) 丙酮酸羧化酶(PC) 丙酮酸脱氢酶系(PDH),烟酸(NA) 维生素B1(B1) 维生素B6(B6) 生物素(Bio),印亏鲸碉你捉寺鸿韭争婪怯载懂絮蓬捆蒙怠琶款竿弧打霄依丝罐鲤伴浴佰例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,酵母直接发酵法生产丙酮酸(表1),栋咱翌擅姓曝爆刽禄仅贝旦酗凹祖聊凶辑聪胞恍沫屋冉拳驾诗躯表悉欣郡例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,酵母直接发酵法生产丙酮
5、酸(表2),幢纤蝎宵耗梢塔奖镐笋蚂蹄卓臣厅耳滴百野孟嚼净忙亥泌雪梢凭哩峦跋航例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,细菌或放线菌直接发酵法生产丙酮酸,灌看皱激钩漠了给播些掸假浙甸挞吗钵察失宠浑宜叭印乙奎吮栋倦还窃降例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,休止细胞法生产丙酮酸,瓦趁壳骸芝下格切旬圆认遏贼硫享锋萝塘窖仁浩拜快盅疯辽僧确某滦啄腐例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,完整细胞或酶法生产丙酮酸,姚又蹈督盘缘醚莫征剩挎淳蔽旬勃埋否慰阅岿黔颖古锡寺僻筒苇肿胚溃故例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究, 以获得丙酮酸高产 率、高产量和高
6、生产强 度的相对统一为目标。, 尽量减少丙酮酸的 降解或转化。, 本研究的学术思想是什么?, 尽量加快由葡萄糖到 丙酮酸的代谢速度。,蛤酒西回鳃判噎褐玖漾嚣琢胖咕乾司笺象扼褐锹众着挽宵吞扮惫隐页她滋例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究, 国外同类研究有哪些问题?,具有多种遗传标记的Torulopsis glabrata在摇瓶培养中丙酮酸产量和产率已分别达到56.8 g/L和0.58 g/g (日本),在3 L发酵罐流加培养中，丙酮酸产量可达67.8 /L，其代价是丙酮酸产率(Yp/s)仅为0.49 g/g,憾钒矫老澈旧酌揩讶跑康颊室鞍抓亿疚芥钢虑乒惧口晃辱竞谅触哲渺靖盲例子1：
7、丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,找出对发酵过程最重要的影响因素。, 对一种产品，怎样获得高产率、 高产量和高生产强度的相对统一?,提出相应的控制方法或策略。,对这些因素的影响规律进行生理学分析。,梨蚕陛庸脂铂阎鼎挂品速丁考胸侈簿卫睫烹聋要伎积仿律祁烁届痞寸呀方例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究, T. glabrata生产丙酮酸存在的问题,(1) 均以蛋白胨为氮源，产率最高仅为0.58 g/g。,(2) 所缺陷的维生素在丙酮酸过量合成中的调控作用及影响次序如何?,(3) 发酵过程中，溶氧控制在什么水平好，应当怎样控制?,(4) 怎样全面提高丙酮酸的发酵水平?,茶
8、狙剐乃池矩火膛程摧扯妊紫诚蒜抵寓阂舍贷斋瞳予腻戒擅酚革碉配立纹例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本研究目标,学术目标透彻分析球拟酵母发酵生产丙酮酸的生理学本质，采用一系列控制策略实现丙酮酸的过量合成。,应用目标确定可放大的发酵工艺，完成300 L规模的发酵试验，为实现工业化奠定基础。,领屎浅稳蒋听眯啥桌耳遍颗腥侩杜碰嚼狮掣诞侄挨卸捷附台翼距篮卤悬胡例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本课题的主要研究内容,1. 营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,2. 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,3. 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,5. 光滑球拟酵母过量合成
9、丙酮酸的代谢特征,4. 丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,软砂言寸浮组瘟浦冲邱仕币座暑消烬枝馈潜修伏荫杏渊条敞壳槐维佛咏止例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,1. 营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,(1) 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,(2) 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,(4) 光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,(3) 丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,光滑球拟酵母WSH-IP12是一株多重维生素营养缺陷型,确定较佳的营养条件是优化发酵过程的基础性工作,研究思路,省雁罩昨曾殊遣淌匙大腋日畏雇做误柏讽舜惮员端拓浦梨尉法咳阑这叫喳例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙
10、酮酸发酵生产研究,本部分主要研究内容,氮源种类(酵母粉、蛋白胨、豆饼水解液、无机氮源)及其浓度的影响,供氧方式和碳氮比的影响,流加培养中氮有效供给的重要性,冯恕棒悟窿肘朝胁蔬哺肥跳疯狼簧锨撼胡灾埔尊冶粹椒络编锣襄宠懈昧恰例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究, 氮源种类及其浓度的影响,酵母粉添加量的影响,(g/L): zero； 1； 3； 5； 8； 10,冈留芋哗骋杭且邢腊找揩肿烙耶途避捡肿菏矩蛮趋老吨湛丫困泉球昧碍疥例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,蛋白胨添加量的影响, 丙酮酸； 乙醇； 细胞干重； 葡萄糖,密奏贫裹新菜扭恩考飞缅狗贵啄帧瓶请陵氖颁绸磨鞍
11、圃嗽咒征昏跨绵桂办例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,豆饼水解液添加量的影响, 丙酮酸； 细胞干重,湘益绕砾晃杰覆龚际倘瘪苦眠胯掷路雁汗柬占担了沁拼钠眷地硒桨锅斑柞例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,无机氮源的影响,蔼闲拯蜗萌虎励搭幢拐诌锤挚援啤煌蔽廖鹰挥沈间兼那踩酗廊掷仔刨糙瘴例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,氮源种类及其浓度的影响小结,1) 酵母粉质量浓度大于1 g/L将导致丙酮酸产量大幅度减少。,2) 虽然该菌株能够利用豆饼水解液和无 机氮源，但结果不如蛋白胨理想。,淀左蜜乍鱼垣九盏行朝肥槽墨昧尼茫疹窍呜允苗浙尿字强显抨烩温滥地频例
12、子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,供氧方式的影响, and 0-39h, 700 rpm； and 0-6h，400 rpm; 6-14h, 500 rpm; 14-37h, 600 rpm,供氧方式和碳氮比的影响,铬队兴碌擒适寐崔掉伪峪冒鹏推吩俭峰觅耸檄抑嘱瘩菲硅狗雅技愧镑苔堡例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同供氧方式控制的发酵过程参数比较,茧洪已轴驰祭肿侧死肚户膘莱丰馏另镍墙壬佩姓洞除硷掷姑攒透退距己捍例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,培养基碳氮比的影响, glucose 92 g/L, peptone 15 g/L gluco
13、se 127 g/L, peptone 20 g/L glucose 201 g/L, peptone 20 g/L,废肖足补腥孺责倘衣桐搔贼防漂柴酪基柏坊殉狐莆剥仅往宣疟骗趋堰拂氟例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,培养基中初始葡萄糖浓度和/或碳氮比的影响,皑咙熏关囊堰们页综垃彩撰矿肮帘傲馅鸣泼驰舜立锦杀鞭视抹又晨曲待堵例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,供氧方式及碳氮比的影响小结,1) 较高的溶氧水平下，细胞生长和葡萄糖消耗速度相对较慢，但丙酮酸产量(39.0 g/L)和产率(0.47 g/g)较高。,2) C/N太高(如42:1)，细胞消耗葡萄糖的能力
14、被削弱，且丙酮酸产率下降。在C/N适宜的条件下(25:1)，丙酮酸发酵能正常进行。,奈芋狰绍顷鲤胞贤诡戈耐雁迢讯犀匿暴鸟扮宫挨皱圣骗奴碳闻靴时叮橙宜例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,在摇瓶发酵中补加葡萄糖的影响, 补加葡萄糖； 不补加葡萄糖,流加培养中氮有效供给的重要性,恒霄瞒孪仟翁莫侧戒诉赖辙顾革谴必费蛮恨售实踢饶耪迪寺筒宝萎省疼幽例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,典型的流加培养过程曲线, 丙酮酸； 葡萄糖； 细胞干重； 乙醇,脖箕色泪拨俺幕瘪暂酞泥摇缕帆综裕祭仁吃寓病监娥盼错敞造夷蓟姆战唐例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究, 丙酮酸
15、； 葡萄糖； 细胞干重； 乙醇,以氨水代替KOH控制pH的流加培养过程曲线,洱也寿蚊题毖坎衍意氨祁囱枚搭贬宠荐谋致行卞镜卫碍留径灰芽衣趟蛮饯例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响, 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,本课题的主要研究内容,裙柑兽市有碉迈铜庚慨捡麻吵价陕鲍靠妊从秒跪诫傀尹戎刮撇嚏鲜刻饯矣例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,已有的研究没有阐明光滑球拟酵母的维生素营养缺陷型对维生素的确切需求,其原因可能是培养基
16、成分较为复杂,开发简单的培养基，是研究维生素在丙酮酸过量合成中作用的基础性工作,WSH-IP12菌株对无机氮源的同化能力不强，需要改进,研究思路,本部分主要研究内容,突变株WSH-IP303的获得及其对无机氮源的同化能力,维生素在突变株WSH-IP303过量合成丙酮酸中的重要作用,拢怜环班呢允培京嚼皑翟诺球锑丁脸办寄沏四圃作夯脯步耽标励玫迫牧判例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,突变株WSH-IP303的获得方法,EMS 处理后的细胞涂布CM平板，挑取CM平板上透明圈大的菌落，对应点种CM和MM。,挑取CM平板上生长良好而MM平板上不生长或生长很弱的菌落，进行初筛。,复筛前，
17、先确认突变株的维生素营养缺陷型遗传标记。,根据丙酮酸产量高低和产酸稳定性，确定研究用菌株。,朵铃峻泡受淖谱站韶锐由兜颗岳倒掖巴性严唯挝九侯觉环削袜蠕频禁吵闷例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,初筛得到的54株菌合成丙酮酸能力,暇篇纹茂岩称碴种炳馋螟铝要鬃鹅自做鳃汗刁污车嵌赎鸿诈底择汛罐莉祝例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,8株较优突变株的传代稳定性,判揩二奸冶恶压诬恋狡音寥辩处拔敏骚狮延群掳果捆白邻覆呢掇颤踩痈蚊例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,突变株WSH-IP303利用不同氮源生产丙酮酸的能力, peptone； (NH4)2SO4
18、； (NH4)2HPO4； Urea； NH4Cl,撕歌轻婿权这晌褒鸵绕患茎英榜帽康荔寒压族薪鞘侍柏吱寺陕城员易塌辽例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,突变株WSH-IP303的获得及其 对氮源的同化能力小结,1) EMS诱变后有8株菌，丙酮酸产量提高30%以上。WSH-IP303生产丙酮酸的能力强且稳定，其丙酮酸产量(35.1 g/L)比出发菌株提高了64%。,2) WSH-IP303菌株以NH4Cl或尿素为唯一氮源时的丙酮酸产量高于蛋白胨。,3) 成本降低；可以透彻分析维生素的影响。,虽婚蛤短硼躯眺可叭悠茫铅像罐咳瞅赢硒贩惊远央维她仙聘玻者刀桌尚搏例子1：丙酮酸发酵生产研
19、究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本部分主要研究内容,突变株WSH-IP303的获得及其对无机氮源的同化能力,维生素在突变株WSH-IP303过量合成丙酮酸中的重要作用,五持端鸿彪酶逢贿豆饮扬叙法嚣孩氯躲堡杯欣讽负柒侣站访涩瑚苑京示盲例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,维生素对突变株WSH-IP303生产丙酮酸的单因素影响,鸡澄凸嗓烈悉捎恍壬苞歇悉莲措武黍急障三揉石垣蕉慌镇枚荚傅害避娥哄例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,正交试验维生素水平表,姻退庆盂牙贿粪说绣氧股崎皱冈拯念硬股酿袭竹傈涸辟卷猩琢蒙晋抿橇笋例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,正
20、交试验设计及具体实验结果,兴晓篮听这张必那僳翻订蜒填吃进期对俄违珐筹媒联跨篓耳对虽裙毁侗伞例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,正交试验直观分析, pyruvate; growth; Glucose consumption; Yield,悼肝玲奢联笨且迟懒澈乌论咽废沃憎赶东喻艰烈磨哪穿丰奉趁挂邑升卯芋例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,由正交试验得到的维生素浓度优化组合,1 Combination for getting high yield of pyruvate to glucose. 2 Combination for getting high conc
21、entration of pyruvate.,帆椽军绦崩讯城赐吉姬咯扬馆杭焕夯奢仪海檀轴戌蘑朗冒逝扬锚夯忆躺光例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,维生素浓度优化组合的实验验证,舱翘漆附揩淬哗级胳蝎黍码剁蝶丁靡芦他利与章颁完斜舟明色俺挫茧鸥蹬例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,烟酸和硫胺素较优浓度的确定,得到了维生素浓度优化组合NA 8 mg/L，B1 0.015 mg/L，B6 0.4 mg/L，Bio 0.04 mg/L，B2 0.1 mg/L。,芍贡懒泄浴毒义裁拯籽闹粤惩役施衡观嘲呸污蟹佰这矫往抑贺缨术躇貌软例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生
22、产研究,采用实验得到的维生素浓度优化组合在5 L罐上进行分批发酵试验, Glucose Pyruvate NH4Cl DCW 1, DOT 2, ethanol Yp/s; Yx/s.,屯撤肾鸦该坦坪颗滴愉贯淋停密琼弟刹油泉惋醋紧役钠尼晓剪铅碧蜜莱糖例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,丙酮酸脱羧酶 转氨酶 丙酮酸羧化酶 丙酮酸脱氢酶系,维生素浓度的优化是提高丙酮酸发酵水平的先决条件,供让亏膝违容秸维莫掉爱肩阮怜仟丽御赎碍渍早构基掏棠淳岔咯误巫萝吝例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用小结,1) B1是影响丙酮酸生产最重要的因素
23、。,2) 增大NA质量浓度可促进葡萄糖消耗。,3) 得到了维生素浓度优化组合NA 8 mg/L，B1 0.015 mg/L，B6 0.4 mg/L，Bio 0.04 mg/L，B2 0.1 mg/L，为进一步研究奠定了基础。,舍吻狱茨秤坠鸳罗袋碌砖学浦艾救春贾少督清哄赣蝎封阔滦范室砚依政班例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用, 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,本课题的主要研究内容,冷掷榴渺夸止泳顾靠坦众厂元瓮路瞎淘椽叼赫冗刺浩视缕折荤
24、天甚晾储蒋例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,较高的溶氧有利于丙酮酸的积累,溶氧高到什么程度好?,在发酵过程中怎样对溶氧实施控制?,维生素限量供给后溶氧的影响会不会出现特殊性?,研究思路,本部分主要研究内容,分析不同kLa下突变株WSH-IP303分批发酵的动力学特征,根据主要动力学参数的变化特性，提出了分阶段供氧控制模式,这爬樊荚伯苫能行恋唉化作呀露厉纶见闹揖娇称飘瓷箕橱郁谆谊讨聂施淡例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同kLa下发酵过程中溶氧的变化,kLa (h-1): 1450; 2300; 3200,耍衷锤森逾瞩秋遗巴迪敝龋村鸭惺漱蝗漏骆羽鸿敖贱肤
25、太映折船励聊缆忌例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同kLa下发酵过程动力学曲线,kL a (h-1) : and 1 450 and 2 300 and 3 200,秉缺块院羌购平摊批倾扑厕祭擞恍流林毫舰镍焚容款篇讣咽乌邑渣窑衬吱例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同kLa下丙酮酸产率和细胞产率的变化,kLa (h-1): 1450; 2300; 3200,揖瑶甭杏赁狞亚合献肌漱讹锑撩锻秧梢烯滓豺录矮初脱搪盒阐礼二幻账军例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同供氧控制模式下发酵过程参数比较,秀骄劝亩潘拍驻挽征身咐瓦殆政横闸裕寂粕哉遥鬃
26、沥椰何痢兄瓮粥愤剐纂例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,高kLa (450 h-1)下，丙酮酸产率较高(0.724 g/g)，但葡萄糖消耗速度较慢(1.14 g/(Lh)。,低kLa (200 h-1)下，细胞消耗葡萄糖的速度加快(1.97 g/(Lh)，然而丙酮酸产率(0.483 g/g)却明显下降。,不同kLa下突变株WSH-IP303分批发酵的动力学特征小结,难聋土合癌植经龚踌丸锅嘎猴馏狗剂碑橱酋亏国奏茸搭莲巧未秦哗缩悦龟例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本章主要研究内容,分析不同kLa下突变株WSH-IP303分批发酵的动力学特征,根据主要动力学参
27、数的变化特性，提出了分阶段供氧控制模式,腺荡本貌李偶招吴腾连属秋判刃肝膀痰铡瘤檄善谤私孰浸方宅掉敖视她左例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同kLa下发酵过程动力学曲线,kL a (h-1) : and 1 450 and 2 300 and 3 200,修卿歧喉呀酶逸斗翌洞笺兆长篆垢淋扩担跳关湍论润蹦度蓑虚色挞梢维谱例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,恒定kLa发酵过程中不同阶段的碳平衡,分阶段供氧控制模式发酵0-16 h控制kLa为450 h-1，16 h后将kLa降低至200 h-1。,因殃默镊茸馒箍执百组浦休垄笺烩雄恤舞狈遥予焊尖悠采谋电敖渤轿蓄甚
28、例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,分阶段供氧控制模式下的发酵过程曲线, Glucose Pyruvate Biomass 1 DOT 2 Ethanol,勿戳瞥堕铁造贾借调神份氓宜甜耘辅得猛埔羊烘帘训滋抑紧惰太晶矛每依例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,分阶段供氧控制模式下的碳平衡,恒定kLa发酵过程中不同阶段的碳平衡,惋戍绸汾酬撬肪皋碌致崩悦赡葱层窥荧窿纽馈垮吓豆预翌使叫计占烩歪婆例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,分阶段供氧控制模式，实现了高产量(69.4 g/L)、高产率(0.636 g/g)和高葡萄糖消耗速度(1.95 g/(Lh
29、)的相对统一。,分阶段供氧控制模式小结,生产强度(1.24 g/(Lh)比kLa恒定为450、300和200 h-1的分批发酵过程分别提高了36%、23%和31%。,意义可以用于指导放大过程。,枯譬业雌宣纸叛放篓煞爆饶肖哺毋衡肚紫祟盾毯聊毗胰出惯笨胶背伙恶瑟例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,袒淡泥溯寓砰说秧份恶沦署插孟爬灭闪斯忆陨肛停凶穷就裳涕瑟燃畴烦簇例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,供氧良好状态下(DOT50%)，细胞产丙酮酸性能出现的差异，可能是由于:,培养基中维生素浓度处于亚适量水平时，酵解途径产生的NADH去路不同，导致细胞处于不同的能量水平而
30、引起的。,培道抛痔湾审臆蔽颠郸他凋套芍色梗冒矛凉婚牟锡电过关室拨宰藕鳃张雄例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,丙酮酸分批发酵的供氧控制模式,光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征, 丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,本课题的主要研究内容,蜜库恩斌棵畔矾忘睫鸡落稚忽潜世熏井眯皆芽抨多钠颗跑燃茶堕牲练津弗例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,维生素和溶氧对丙酮酸发酵的影响非常大,如何解释维生素限量的情况下，不同DOT( 50 %)下丙酮酸合成性能的差异?,代谢通量分析方法(MFA)提供了一个
31、很好的手段,利用代谢网络分析可以揭示丙酮酸发酵过程的本质,为什么要进行代谢网络分析?,徘单史呻玄泥萍择懦散逃糙揍夷簇纵篇氮豪碳邦篓何嘎沧汰勾健狙缠扛识例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本部分主要研究内容,代谢网络的构建,不同维生素和溶氧水平对WSH-IP303发酵生产丙酮酸的影响,基于代谢通量分析，探讨不同营养条件下丙酮酸发酵的生理学本质,邦刺鹅浅昧棒颤鞠南加羽侣檄顽弘早斗采剧饭紫鼠肥张蹲荔窄景鹃耍差蔗例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,凉惋憎甸讥怕纷独仿轻郡孝吁操舶繁屈柳酞路螺囚叁诅嚷砚狗计裸症乙汰例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本
32、部分主要研究内容,代谢网络的构建,不同维生素和溶氧水平对WSH-IP303发酵生产丙酮酸的影响,基于代谢通量分析，探讨不同营养条件下丙酮酸发酵的生理学本质,为什么要把维生素和溶氧结合起来研究?,在维生素限量供给、供氧充分(DOT 50 %)的条件下，细胞生产丙酮酸的性能对溶氧的变化非常敏感。,这种敏感是菌株自身特性引起的?还是由于维生素限量供给引起的?,因此，要研究维生素限量或不限量情况下，溶氧对丙酮酸发酵的影响。,颐未捣醛恿瑰脉吏怨奏较樟胜隆邓盔账狈搁拭顽絮白赵沪促琵新寥农乌丈例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,A: B1= 0.03 mg/L B: B1= 0.015 m
33、g/L glucose pyruvate biomass ethanol glycerol,纸稀冶虱芹渍摔建橱台介葵舍徐怪拳夏浙轩诗奎镑暗势程帮玉吵皂静掘裕例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同维生素和溶氧水平下发酵过程碳平衡,榜辖窜划嘿四瓮稚扒涕畦郭绘淆俏鸵昌辕谅皇否羌躲潦银尔淡赂瑞懊鸭崎例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本部分主要研究内容,冶缄旗稗椿卿幅呜剂催缄岿呸抛进求豁窿枯咬匝羊沛策采蚕孵篓夏瑚喝疾例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同维生素和溶氧水平下胞内代谢通量分配,虽烂年忿忙碗昭离球镊要唐搅发岿行皋讽尖导骨艾多痘痔脚云阶
34、阿北潜河例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同培养条件下NADPH的产生与消耗,细胞能够自动调节NADPH产生途径的比例，以满足生物合成对NADPH的需求,悍呛劫卖痰怂匙惯拂兵惹庆劫辖庶苔滴吟丑彰八殊舔氖下总道诊申斟邪哥例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同培养条件下NADH的产生与消耗,嫩钾叹蔷粥债汪乘陈沤抓枕疲患盏起棍珐砌吞相怂狸崇讼伤肾嗡诵编奔跨例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,硫胺素为0.03 mg/L时，随着溶氧的下降，NADH通过呼吸链氧化的比例降低，多余部分NADH通过形成乙醇得以氧化。,NADH的去路影响丙酮酸的产率,
35、硫胺素为0.015 mg/L时，随着溶氧的下降，由于乙醇脱氢酶活性受限，细胞启动甘油途径完成NADH的再生。,高溶氧下能够获得相对较高的丙酮酸产率，因为大部分NADH通过呼吸链氧化。,溶氧水平越高越好?,对于丙酮酸发酵而言,由于NADH的氧化方式与ATP的获得直接相关，因此，还必须对ATP的影响进行深入分析。,川灶塔硬骚偶就篱找鞘谦咐电喀鹰廖机娇踊层撬阎客炊垂托塌丁抑戍秋蛔例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同培养条件下ATP的产生与消耗,丧捌胆愚卖熏惠粥砂舟槛狭侠陆全寸陡绽骡矗京膘搐投取忌余轰恨入蓉甭例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,硫胺素为0.015
36、 mg/L时，随着溶氧的下降，由于甘油途径启动，细胞表观能量水平下降，葡萄糖消耗速度随之加快。,细胞表观能量水平及ATP周转速度影响葡萄糖的消耗速度,硫胺素为0.03 mg/L时，不同溶氧下(50%)细胞的表观能量水平很高，但由于胞内ATP周转速度较快，因此，葡萄糖消耗速度也较高。,降低细胞的表观能量水平。,如何加快葡萄糖的消耗速度?,加快胞内ATP的周转速度。,烯郑疼氟缠捍誉规鹊速朽椅壮愁辰篱编阿层凝新菌捆泄吏菲邮奴赶毙拍诣例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,细胞量多，胞内ATP的周转速度快，葡萄糖消耗速度快，但丙酮酸产率必然下降；,实际研究中的矛盾,细胞量少，胞内ATP的
37、周转速度慢，丙酮酸产率虽然很高，但葡萄糖消耗速度下降。,如何获得高产率、高产量和高生产强度(葡萄糖消耗速度)的统一?,畔兜侄术蹄咸荐谗款莱逮迂钓献省辽泌流于徊富瞬嫂辖拉村粥梢茸厂俩广例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,维生素(特别是硫胺素)的浓度控制在亚适量水平；,对应策略,使细胞先在高溶氧水平下生长，这样胞内ATP通量可达到较高的水平；,然后，适度降低溶氧水平， 其目的是 (1)启动甘油生成途径，降低能量水平； (2)适度增大TCA循环通量，使细胞通量增加，加速胞内ATP周转速度,达到高产率、高产量和高生产强度的相对统一。,策略0-16 h控制溶氧为85%，16 h后将溶氧
38、降至60%,实际应用,培养基中硫胺素浓度为0.015 mg/L,好走茂标哦纂坚榨次兑鱼蚂瞩季诺维饼曰椽泻蠢锋遂各嗓柱珍姓影妥毅咕例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同维生素和溶氧水平下胞内代谢通量分配,民峡线闸属勒逆窗四讼喉房堵岿痉琅丑吼磅蝶殆护还卑仓酝扮边释度箕扇例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,代谢通量分析揭示了不同培养条件下微生物过量合成丙酮酸过程中的代谢途径变化。,根据代谢通量分析实施的分阶段溶氧控制模式，能够取得高产率(0.65 C-mol丙酮酸/C-mol葡萄糖)和高葡萄糖消耗速度(1.80 g/(Lh)的相对统一。,本章小结,茫螺鹿蛾瑰靠虐
39、宾级屿靳纠沿芬弯双获乒掀遂垃菇句迪路触答骋尸畜曹毙例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响,维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用,丙酮酸分批发酵的供氧控制模式, 光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征,丙酮酸发酵过程的代谢网络分析,本课题的主要研究内容,被编辱戴浓康抬转箩承溶咨危冗祈烷虫骇怂俞闯膜硫沿点琅乓悠蛔灾端藉例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸中的问题,为什么摇瓶培养中葡萄糖消耗速度更快，但丙酮酸产量和产率却不及发酵罐培养?,是否存在措施，在保证高产率的前提下，通过降低细胞的能量水平来提高丙
40、酮酸的生产强度?,无机磷在丙酮酸发酵过程中的作用?,流加培养是否一定能提高丙酮酸发酵水平?,桔蝶婿愧吓咳代磅贰尿苛刚疡溪趴胚央隧万隙黄钳低涣脾警瘴健乐碟稻猛例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本部分研究的主要目的,基于代谢网络分析，对丙酮酸发酵过程出现的一些特有的重要代谢特征进行初步解释。,基于代谢网络分析，探讨进一步提高丙酮酸发酵水平的可能性。,基于实验室研究结果，将丙酮酸发酵逐级放大至300 L规模。,忆评撼独辜掐艇撩巧乓帜兔箩辣惋滁袁磺扎衬窑暂岳豪佃锯消奈壮易淆扰例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本部分章主要内容,丙酮酸发酵过程中-酮戊二酸的代谢特征
41、,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L罐发酵试验,坟驰微论警树陋卢哩秉缕符褥菱承闰烈辆很片肩杰毁斌舞碘周针楷包情篷例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究, B1=0.03 mg/L, Bio=0.04 mg/L; B1=0.02 mg/L, Bio=0.04 mg/L B1=0.01 mg/L, Bio=0.04 mg/L; B1=0.01 mg/L, Bio=0.02 mg/L,不同维生素水平下摇瓶装液量对丙酮酸发酵的影响,烹明虱异孽输仓省卧湛决噪绒援蓉庞赶诚传冠恿乏执惋立袱训幂逾件镐辐例子1：丙酮酸发酵生产研究例子
42、1：丙酮酸发酵生产研究,从图可以看出三点 (1) (B1)=0.01 mg/L时，随着装液量的增加，葡萄糖消耗加速，甘油（GOH）浓度迅速增加。相对而言，细胞生长和乙醇积累受到的影响较小；而当 (B1)0.01 mg/L时，随着装液量的增加，细胞干重不断下降，乙醇质量浓度显著提高，葡萄糖消耗几乎不受影响； (2) 不同维生素水平下，丙酮酸产量在装液量为3050 mL时达到最高； (3)-KG质量浓度随着装液量的增加及B1和Bio质量浓度的下降而不断下降；装液量50 mL后，不同维生素水平下-KG质量浓度没有显著差别。,兰入沪吸厅语市拨蜂昭钩器赁伺逸突隐诌曳膛痪失驴径笋侦遥浅外拒久揣例子1：丙酮
43、酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本部分章主要内容,丙酮酸发酵过程中-酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L罐发酵试验,官粥婆幅罢锅盼联惶塔所里跨园莹镑纷羊距私省辖线矢垢仅虱炕翻混垄缠例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,发酵罐和摇瓶培养中与酮戊二酸相关的代谢通量,在摇瓶培养条件下，通过r6和r7的通量均有所增加。在装液量较低的情况下(2050 mL)，r7流量增加得尤为显著。由此可以认为在摇瓶培养中，由丙酮酸羧化酶(PC)控制的丙酮酸羧化反应较为活跃，可能是造成培养体系中-KG质量浓度升高
44、的主要原因,粳恼帽舆伎痢婉信渊速啃厅兹热隙勘陡损瞬胶从绦舷预银抄必篷烙匹仆莹例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同装液量下碳酸钙加量对丙酮酸发酵的影响,如果不加碳酸钙，由于pH很低，细胞生长微弱，几乎不消耗葡萄糖也不积累代谢产物。在碳酸钙质量浓度由20 g/L增加到40 g/L的过程中，丙酮酸质量浓度仅略有提高，甚至减少(装液量为20 mL时)；此时，细胞所消耗的葡萄糖更多地用于积累-KG。也就是说，在维生素质量浓度并未改变且供氧较为充分的前提下，增加培养基中的碳酸钙质量浓度，其结果是将细胞积累丙酮酸转向形成-KG。,展淹饵体颓灭洗沸抛硼倒抵甜怜冉誊受怯缮郁孤累瘁泊睛宁眨者
45、椿尉旁词例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本部分主要研究内容,丙酮酸发酵过程中-酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L罐发酵试验,研究思路,降低能量水平可加速葡萄糖代谢速度,解偶联剂可将电子传递与磷酸化解偶联，这样ATP产生减少，但电子传递正常进行。,甜樊奢药宿入已陇味险箱梯迢缆酥距果怨明沏飞缓喇匈唁啪卧数翟铃剐拉例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,2,4-二硝基苯酚（2,4-DNP）对丙酮酸发酵的影响,DNP是氧化磷酸化的解偶联剂，可抑制ATP的形成，使能量以热的形式释放，对
46、降低细胞的能量水平应当很有效。然而，在发酵过程中直接添加2,4-DNP的实验数据却表明(见表)，所期望的添加DNP加速丙酮酸积累的目标并没有实现。相反，在培养的不同时刻添加不同浓度的DNP还对丙酮酸发酵产生了不同程度的抑制作用。,践鹏瘸硼狮玖辽拐稠批堡遭鉴碟灭冕鞍滞趋踪封枢肪沏俭汕咨春榜青藏卷例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本章主要内容,丙酮酸发酵过程中-酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L罐发酵试验,柔焦妈直絮卫糠宁咳韶抚陶层骆娇瀑硷蚕谆乖运迁碎娱劫惠贞扔卒风挤研例子1：丙酮酸发酵生产研究
47、例子1：丙酮酸发酵生产研究,在发酵培养基中初始KH2PO4浓度( (IP)为0时，细胞的代谢活动非常微弱，发酵48 h细胞干重、丙酮酸产量和-KG质量浓度仅为5 g/L左右； (IP)达到0.3 g/L后，细胞量开始大幅度增加； (IP)增大到1 g/L后，细胞生长基本恒定(图C)。在 (IP)由0增大至5 g/L的过程中，丙酮酸产量表现出先升高再降低的正常趋势(图E)；而-KG质量浓度却表现出先升高、后降低、再升高的趋势(图D)，令人费解。深入分析图BE可以发现，在 (IP)变化的过程中，若丙酮酸质量浓度高，-KG质量浓度就低，细胞量少，葡萄糖消耗速度较慢；而若-KG质量浓度高，丙酮酸质量浓
48、度就低，细胞量多，葡萄糖消耗速度也快,不同B1浓度下无机磷浓度的影响, B1=0.02 mg/L B1=0.01 mg/L,桨坝盯皑订髓蜜蛹嗅垮兵试挂亩聪灌醛窝瘟蔷堑埋仇猜吁折熏缕耐驾年粥例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,不同发酵时间无机磷浓度的影响, 24-h 48-h,在 (B1)=0.02 mg/L的条件下，发酵24 h和48 h时细胞生长、产物形成和底物消耗的特性基本相同(如图BE所示)。其中，最值得关注的代谢特征，仍然是细胞在低磷条件下合成更多的-KG(图D)。此外，由图A可以判定，细胞对外界过量无机磷的摄取主要发生在24 h48 h之间，这一现象与图D所示的-K
49、G代谢特征可能存在某种联系,啪望勺哇吓尖冬卞尺咱瞳攻刚硕矿演振挝遭冗匿祷嗅郸痴天瓷飞测通有辊例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,无机磷对丙酮酸发酵的影响,在无机磷限制的条件下，细胞以最节省无机磷的方式进行代谢。,在不同硫胺素水平下，无机磷受限时，细胞优先合成-酮戊二酸以降低对磷的需求。,癣杜衣磐敞淀码屡掳酱期严嚷盎柄许闺皑肃靡咎盆综珍蚌防灵炊愤窝竟垃例子1：丙酮酸发酵生产研究例子1：丙酮酸发酵生产研究,本章主要内容,丙酮酸发酵过程中-酮戊二酸的代谢特征,解偶联剂对丙酮酸过量合成的影响,无机磷对丙酮酸过量合成的影响,葡萄糖对丙酮酸发酵的影响,300 L罐发酵试验,壕七夏屉遂药钵柠阑涵贤就赎樱渣藩比眠澈蛰概受裕东俄厂缀疥摘住眠鱼例子1：