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1、基因工程操作的工具酶,1,第二章 基因工程操作的工具酶,基因工程操作的工具酶,2,2.1 基因工程工具酶,基因工程操作的工具酶,3,1.工具酶的概念 2.限制性内切酶 3.DNA聚合酶 4 DNA连接酶 5.碱性磷酸酶 6 末端转移酶 7 核酸酶S1 8 T4多核苷酸激酶,基因工程操作的工具酶,4,1.工具酶的概念 应用与基因工程的各种酶的总称. 切: 连: 修饰:,基因工程操作的工具酶,5,2.限制性内切酶,主要从细菌中分离得到，核酸水解酶。酶识别特定的核苷酸顺序，但在细菌本身的DNA中，这些顺序已被甲基化修饰，因而不被水解；这些酶仅限于水解外源DNA以保护自身，故称之为“限制性”酶。 以内
2、切方式水解DNA，产物的5为p， 3 为OH。,基因工程操作的工具酶,6,限制性内切酶的发现,Luria和Human发现： K噬菌体 -Ecoli B噬菌体- Ecoli 广泛存在于原核细菌 。,基因工程操作的工具酶,7,由宿主控制的对外源DNA的限制(restriction)和对内源DNA的修饰(modification)现象称为宿主细胞的限制和修饰作用。,基因工程操作的工具酶,8,作用： 一：保护自身DNA不受限制； 二：破坏入侵的外源DNA，使之降解。,基因工程操作的工具酶,9,Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割DNA，这个酶被命名为Hind I,这是
3、第一个分离到的限制性内切核酸酶。,基因工程操作的工具酶,10,限制性内切酶的定义,指限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。,基因工程操作的工具酶,11,限制性内切酶分类,根据限制性内切酶的识别顺序与切割位置是否一致，将它们分成三类。 型型限制性内切酶： 型限制性内切酶： 型限制性内切酶：,基因工程操作的工具酶,12,I型限制性核酸内切酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性，其切割作用是随机进行的，一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位置上切割，不产生特异片段。,基因工程操作的工具酶,13,
4、型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白质复合物，具有限制与修饰双重作用。 切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处，无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同酶的这一距离不同 。,基因工程操作的工具酶,14, 型限制性内切酶： 3个基本的特征： 在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子；识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp,识别位点经常是一种回文序列的DNA.,基因工程操作的工具酶,15,限制性酶的识别序列一般为48个核苷酸，这些序列大多呈回纹结构。 Eco R识别6个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割DNA分子。 5 GA A- T T C 3 3 C T T A AG 5,
5、基因工程操作的工具酶,16,Pst 酶切 5 C T G CAG 3 3 GAC GT C 5 Sma酶切 5 C C C GG G 3 3 G GG C C C 5,基因工程操作的工具酶,17,Bal酶切识别6个核苷酸的序列，在特定的G-C之间切割DNA分子： 5 T G G CC A 3 3 G AC GG T 5,基因工程操作的工具酶,18,基因工程操作的工具酶,19,2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的； Pst 酶切 5 C T G CAG 3 3 GAC GT C 5,基因工程操作的工具酶,20,断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。 EcoR：
6、 5 GA A- T T C 3 3 C T T A AG 5,基因工程操作的工具酶,21,限制性核酸内切酶的命名,按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3 种限制酶， 则分别命名为Hind、Hind和Hind。,基因工程操作的工具酶,22,常见的限制性内切酶 限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点 EcoR GAATTC Hind GTPyPuAC Hind AAGCTT BsuR I GGCC
7、,基因工程操作的工具酶,23,Pst CTGCAG Sma CCCGGG Xba TCTAGA Xho CTCGAG BamH GGATCC Not GCGGCCGC,基因工程操作的工具酶,24,5 GAATTC-3 EcoRI G AATTC 5 粘端 3 CTTAAG-5 CTTAA G 5 CTC GAG-3 Pst I CTCGA G 3 GAG CTC-5 G AGCTC 3 粘端 5 CCC GGG-3 Sma I CCC GGG 平末端 3 GGG CCC-5 GGG CCC,基因工程操作的工具酶,25,限制酶产生末端的连接,a、粘性末端互补 -CTCGAAGCTTGTTC- -
8、 GGCAAGCTTACT- -GAGCTTCGAACAAG- - CCGTTCGAATGA HindIII酶解 HindIII酶解 -CTCGA- - AGCTTGTTC- - GGCA- - AGCTTACT- -GAGCTTCGA- -ACAAG- - CCGTTCGA- - ATGA- 混合退火 -G G C A A G C T T G T T C- -C C G T T C G A A C A A G- 切口,基因工程操作的工具酶,26,b、不匹配末端连接,-AAGCTT- -TCTAGA- -TTCGAA- - AGATCT HindIII Xba I -A CTAGA- -TTC
9、GA T Klenow酶填补 -AAG CTAGA- -TTCGA TCT- - A A G C T A G A - - T T C G A T C T -,基因工程操作的工具酶,27,C.平末端连接,-AAGCCCGGGTCG- - GGAGGTTAACCT- -TTCGGGCCCAGC- - CCTCCAATTGGA SmaI酶切 AAGCCC-OH P-GGGTCG- - GGAGGTT-OH P-AACCT TTCGGG-P OH-CCCAGC- - CCTCCAA-P OH-TTGGA- 混合退火 OH P -GGAGGTT GGGTCG- -CC TCCAA CCCAGC,基因工程
10、操作的工具酶,28,内切酶的切割方式,1.同位酶：具有相同的识别序列，但是酶切位点不同。 SmaI(CCCGGG)和XmaI (CCCGGG),识别序列相同，但切割位点不同，前者产生平头末端，后者产生黏性末端它们是一对同位酶。,基因工程操作的工具酶,29,2.同尾酶：具有不同的识别序列，但是酶切产物有相同的末端结构。 如BamH I(5-GGATCC-3)与Bgl (5-AGATCT-3)的酶切片段可以彼此连接起来 。,基因工程操作的工具酶,30,3.同裂酶：来自不同物种，但是识别序列和酶切位点均相同。 例如： Hpa5-GTTAAC-3；Hinc酶切GTYRAC,基因工程操作的工具酶,31,
11、核酸内切酶的缓冲液性质,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等， 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星活性（Star activity）现象.,基因工程操作的工具酶,32,EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3,基因工程操作的工具酶,33,基因工程操作的工具酶,34,大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶: 可在5 GATC3序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。 dcm甲基化酶 此酶在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶
12、是EcoR II。,基因工程操作的工具酶,35,3腺嘌呤脱氧核苷酸,(3 d AMP ),H,O,H,O-,P,O,CH2,O,O,H,H,H,NH2,N,H,N,N,CH,N,9,HO,基因工程操作的工具酶,36,N,O,N,H,C,CH3,NH2,5胞嘧啶核苷酸,(5 CMP ),H,O,H,O-,P,O,CH2,O,O-,H,H,OH,OH,基因工程操作的工具酶,37,甲基化酶在基因工程中用途: 许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。,基因工程操作的工具酶,38,型限制性核酸内切酶的反应条件,在合适的温
13、度和缓冲液中，在20l反应体系中，1 h完全降解1gDNA所需要的酶量，称为一个单位的限制性核酸内切酶。 酶过量可导致识别序列的特异性下降 。,基因工程操作的工具酶,39,应注意的问题,1浓缩的酶液要稀释（不能用水） 2 低温保存 一20稳定保存,基因工程操作的工具酶,40,影响限制性核酸内切酶活性的因素,(1).DNA的纯度 。 DNA制剂中的其他杂质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠(SDS)以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制限制性核酸内切酶的活性。,基因工程操作的工具酶,41,(2).DNA的甲基化程度 。 内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列 。 通常使用丧失了甲基
14、化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 若要使用合成的衔接物修饰DNA片段的末端，被酶切之前，通过甲基化将内部的限制酶识别位点保护起来。,基因工程操作的工具酶,42,（3）酶切反应的温度 。 大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是37，但 Sma是25，ApaI是30,基因工程操作的工具酶,43,（4）DNA的分子结构。 超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高达20倍 。,基因工程操作的工具酶,44,（5）限制性核酸内切酶的缓冲液。 标准缓冲液的组分包括： 氯化镁、氯化钠或氯化钾、TrisHCl、一巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。 酶活性需要2价阳离子，通
15、常是Mg2+。,基因工程操作的工具酶,45,3. DNA聚合酶,分为两类： 依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。,基因工程操作的工具酶,46,DNA聚合酶,(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)： 也称为Kronberg酶，是Kronberg等1956年发现的第一个DNA聚合酶。 具有三种酶活性 a、5 -3DNA聚合酶活性 CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATA
16、GCCT GGCTATCGGA Mg2+ dNTP GGCTATCGGA,基因工程操作的工具酶,47,b、3 -5 外切酶活性 CGCATCG-OH E.coli DNA pol I CGC ATCG GCG Mg2+ dNTP GCG 校正作用。 c、5 -3外切酶活性 CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAG GCGTAATC Mg2+ GCGTAATC,基因工程操作的工具酶,48,(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，Klenow片段或K1enow聚合酶。只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5 -3外切酶活性。 具有53聚合酶活性； 35外切酶活性。,基因
17、工程操作的工具酶,49,Klenow酶的基本用途： a.补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 b.DNA片段的同位素末端标记 c.cDNA第二链的合成 d.双脱氧末端终止法测定DNA序列,基因工程操作的工具酶,50,(3)Taq DNA聚合酶,是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5- 3聚合酶活性和35外切酶活性，需要Mg2+作辅助因子， 该酶最适反应温度为7580。 主要用途是进行PCR反应。,基因工程操作的工具酶,51,(4) 逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶） AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒） , M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒）。 AMV逆转录酶反应的
18、最适温度为4145，最适pH为8.3。,基因工程操作的工具酶,52,主要作用是将mRNA反转录成cDNA a.DNA聚合酶活性b.RNase H活性（特异地降解DNA:RNA杂交分子中的RNA链 ） c.DNA内切酶活性d.DNA指导的DNA聚合活性,基因工程操作的工具酶,53,T4噬菌体DNA聚合酶,来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌， 具有：53聚合酶活性 35外切酶活性， 外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强。 外切酶活性比Klenow酶高1001 000倍。,基因工程操作的工具酶,54,可以补平或标记带3凹陷末端的DNA分子，可进行平头末端或3突出末端的双链DNA的标记。,基因工
19、程操作的工具酶,55,T7噬菌体DNA聚合酶,持续合成能力最强的酶。 具有很强的对单链和双链DNA的35外切酶活性. 主要用于催化大分子模板(如M13噬菌体)的引物延伸反应，它可以在同一引物模板上有效地合成数千个核苷酸且不受二级结构的影响；,基因工程操作的工具酶,56,测序酶,测序酶是通过化学修饰对T7噬菌体DNA聚合酶进行改造的酶， 去除T7噬菌体DNA聚合酶的35外切酶活性，保留聚合活性， 具有很强的持续合成能力，是Sanger双脱氧链终止法测序的理想用酶 。,基因工程操作的工具酶,57,4. DNA连接酶,1967年发现。 两条DNA链之间形成磷酸二酯键。DNA ligase. Ecol
20、i和其他细菌：能源（NAD+). 动物细胞及噬菌体：能源（ATP).,基因工程操作的工具酶,58,连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。 (1). T4噬菌体DNA连接酶 不受dNTP的抑制，催化DNA片断的连接。 (2). E.coli DNA连接酶 不能连接平端DNA,不能连接RNA。,基因工程操作的工具酶,59,DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50 - 100 mM ,pH 7.5 MgCl2 10 mM,ATP 0.5 - 1 mM,DTT 5 mM Volume: 10 - 20 l T T:4 - 15 , 4 - 16 hr 1
21、 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下,15 反应1 小时，完全连接1 g -DNA（Hind III片段）所需的酶量.,基因工程操作的工具酶,60,平头双链DNA片段的连接操作 粘性末端的连接属于分子内部的连接. 平头末端的连接属于分子间的连接，反应速度慢.,基因工程操作的工具酶,61,提高平头末端连接效率的方法包括： a.加大连接酶用量. b.加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 c.加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 d.加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,基因工程操作的工具酶,62,5. 碱性磷酸酶,去除DNA或者RNA的5磷酸，可防
22、止自身环化。 5pDNA 5OHDNA 5pRNA 5OHRNA,基因工程操作的工具酶,63,分类： （1）BAP(bacterial alkaline phosphatase） :细菌碱性磷酸酶，来源于大肠杆菌 。 活性高，但耐高温和去污剂，抑制其活性较难。 （2）CIP（calf intestinal alkaline phosphatase ）:牛小肠碱性磷酸酶，来源于小牛肠 。 蛋白酶K消化，EDTA参与下，65加热1小时灭活。,基因工程操作的工具酶,64,碱性磷酸酶的主要用途有： （1）5末端标记前的处理； （2）去除DNA片段的5磷酸基团，防止自身连接；,基因工程操作的工具酶,65
23、,6.末端转移酶,分子量60000D,在二价阳离子的作用下，催化dNTP加于DNA分子的3羟基端。 底物： 带3羟基端单链DNA或带3羟基突出端的双链DNA。,基因工程操作的工具酶,66,用途： 1.载体或者cDNA加同聚尾。 2 .标记DNA3末端。,基因工程操作的工具酶,67,7.核酸酶S1,S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） 水解单链核酸以及双链核酸中的单链区或单链末端，产生5核苷酸和5末端为p的寡核苷酸。 Zn2+必需,最适pH范围为4.0 - 4.3,需要NaCl 10 - 300 mM. 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍。
24、,基因工程操作的工具酶,68,S1核酸酶降解单链DNA或RNA,产生带5磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。需要辅助因子Zn。 用途： (1) 去除DNA片断中突出的单链尾以产生平端。 (2) 打开双链cDNA合成中产生的发夹。,基因工程操作的工具酶,69,带切口的双链DNA S1核酸酶,基因工程操作的工具酶,70,8 .T4噬菌体多核苷酸激酶 催化ATP的-磷酸基团转移到DNA或RNA的5末端。 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。已在多种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸激酶。,基因工程操作的工具酶,71,用途： 1 .标记DNA或RNA5末端。 2.对缺乏5磷酸基团的DNA进行磷酸化或者合成接头进行磷酸
25、化。,基因工程操作的工具酶,72,9. DNase ,从牛胰中分离到的内切酶，水解双链DNA比单链DNA迅速，随着反应进行，双链底物减少，单链浓度增加，反应自动减速。 酶反应的最适pH在7左右，Mg2+、 Mn 2+和 Co2+是激活剂。,基因工程操作的工具酶,73,10.核糖核酸酶A,特异攻击RNA上嘧啶残基的3端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。 举例：5pApGpCpCpGpApApUpGpCpApG3 5pApGpCp?,基因工程操作的工具酶,74,5pApGpCpCpGpApApUpGpCpApG3 5pApGpCpCp GpApApUp GpCp ApG,基因工程操作的工具酶,7
26、5,RNaseU2,RNaseU2的碱基专一性与RNase A互补，特异水解RNA链中嘌呤核苷酸的3-磷酸基团与相邻核苷酸的5-OH之间的键，生成以3-嘌呤核苷酸和以3-嘌呤核苷酸为末端的寡核苷酸。,基因工程操作的工具酶,76,11.核糖核酸酶T1,一种内切核糖核酸酶。特异作用于鸟嘌呤核苷酸3端磷酸并切断相连的磷酸二酯键。 举例：5pApGpGpCpCpGpApApGpUpGpCpApGpC 5pApGp Gp ?,基因工程操作的工具酶,77,5pApGpGpCpCpGpApApGpUpGpCpApGpC 5pApGp Gp CpCpGp ApApGp UpGp CpApGp C,基因工程操作
27、的工具酶,78,本章小结,1 工具酶 2 限制性内切酶 3 聚合酶 连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 核酸酶S1 T4噬菌体多核苷酸激酶,基因工程操作的工具酶,79,1.给你一种mRNA,按适当顺序列出从mRNA 的cDNA克隆到表达载体你所运用到的所有酶？,基因工程操作的工具酶,80,答案：(1) 逆转录酶 (2)DNA聚合酶 (3)S1核酸酶 （4）限制性内切酶 (末端核苷酸转移酶） (5) DNA连接酶,基因工程操作的工具酶,81,思考题,1 什么是限制修饰？ 2 在基因工程中应用最广泛的是 型限制性内切酶。 3 Eco R 的识别切割序列是： 。 4 具有相同的识别序列，相同的酶切位点的酶叫 。,基因工程操作的工具酶,82,5 浓缩的酶液可以用水稀释。（ ） 6 酶切反应的温度是37。（ ） 7 依赖于RNA的DNA聚合酶是 。 8.防止DNA自身环化的酶是 。 9 能够在DNA分子的3羟基端加dNTP的酶是 。,