1、第三章第三章 维生素的测定维生素的测定 维生素广泛存在于各种生物体中，其种类维生素广泛存在于各种生物体中，其种类繁多，化学结构与生理功能各异。因此无法按繁多，化学结构与生理功能各异。因此无法按照结构或功能分类。照结构或功能分类。按其溶解性可分为按其溶解性可分为脂溶性脂溶性(VA(VA、VDVD、VEVE、VK)VK)和和水溶性水溶性(V VBlBl、V VB2B2、V VB6B6、V VBl2Bl2、V VP P、V VPPPP、VcVc)两大类。两大类。1 1维生素是人体生命活动不可缺少的营养物质，它们维生素是人体生命活动不可缺少的营养物质，它们一般在动物和人体内不能合成或合成数量少，满足一
2、般在动物和人体内不能合成或合成数量少，满足不了动物和人体的需要，必须依靠从食物中摄取。不了动物和人体的需要，必须依靠从食物中摄取。在食物中缺乏了任何一种维生素，人和动物都会发在食物中缺乏了任何一种维生素，人和动物都会发生特有的缺乏症状，生特有的缺乏症状，如缺乏维生素如缺乏维生素A A、B B和和C C时，可分时，可分别引起夜盲症、脚气病和坏血病等，严重时足以致别引起夜盲症、脚气病和坏血病等，严重时足以致命命。某些维生素含量的高低，是评价农产品品质的。某些维生素含量的高低，是评价农产品品质的重要指标之一。重要指标之一。2 2l 维生素是维持人体正常生理功能所必需的一类有维生素是维持人体正常生理功
3、能所必需的一类有机化合物。机化合物。l 维生素按其溶解性可分为：维生素按其溶解性可分为：水溶性维生素水溶性维生素 抗坏血酸（抗坏血酸（VcVc）具有酸性和强还原性，水果具有酸性和强还原性，水果中柑橘、柠檬含量较高，为中柑橘、柠檬含量较高，为40-50mg%40-50mg%，红果和枣的，红果和枣的含量更高，枣中含量更高，枣中540mg%540mg%。3 3 硫胺素（硫胺素（VBVB1 1）缺少，则神经组织功能不足，可出现相缺少，则神经组织功能不足，可出现相应的神经肌肉症状如多发性神经炎、肌肉萎缩及水肿。谷类、应的神经肌肉症状如多发性神经炎、肌肉萎缩及水肿。谷类、豆类及肉类含量较多，动物性食品中以
4、肝、肾、脑含量较多。豆类及肉类含量较多，动物性食品中以肝、肾、脑含量较多。核黄素（核黄素（VBVB2 2）需要量与能量代谢有关。动物性食品需要量与能量代谢有关。动物性食品比植物性食品含量高，肝脏达比植物性食品含量高，肝脏达2mg/100g 2mg/100g 烟酸（烟酸（VppVpp）可预防癞皮病发生。含量最多的是蘑可预防癞皮病发生。含量最多的是蘑菇、酵母等，肝脏为菇、酵母等，肝脏为10mg/100g10mg/100g。叶酸叶酸 叶酸为各种细胞生长所必需。动物肝叶酸为各种细胞生长所必需。动物肝脏、豆类、各种绿叶蔬菜和水果含量较多脏、豆类、各种绿叶蔬菜和水果含量较多。4 4 维生素维生素B B6
5、6 可帮助糖类、脂肪和蛋白质分解、利用，也可帮助糖类、脂肪和蛋白质分解、利用，也帮助糖元由肝脏或肌肉中释放热能。蛋黄、肉、鱼、乳，以及帮助糖元由肝脏或肌肉中释放热能。蛋黄、肉、鱼、乳，以及谷类、种子外皮、蔬菜含量丰富。谷类、种子外皮、蔬菜含量丰富。维生素维生素B B1212 唯一含金属（钴）的维生素，机体中含量降至唯一含金属（钴）的维生素，机体中含量降至0.5mg/100g0.5mg/100g左右便会出现贫血，即恶性贫血。主要来源为肉类，左右便会出现贫血，即恶性贫血。主要来源为肉类，以内脏、鱼类、蠔类及蛋类为多。以内脏、鱼类、蠔类及蛋类为多。泛酸（泛酸（VBVB3 3）与糖类、脂肪和蛋白质代谢
6、有密切关系。广与糖类、脂肪和蛋白质代谢有密切关系。广泛存在于动、植物食品中。泛存在于动、植物食品中。生物素生物素 参与体内的固定参与体内的固定COCO2 2（羧化）和转羧基作用。分（羧化）和转羧基作用。分布广泛，肠道细菌亦能合成。布广泛，肠道细菌亦能合成。5 5n 脂溶性维生素脂溶性维生素 V VA A 具有促进正常生长与繁殖、维持上皮组织与视力正常的具有促进正常生长与繁殖、维持上皮组织与视力正常的生理功能。只存在于动物性食品中，肝、肾鸡蛋、鱼卵和全奶生理功能。只存在于动物性食品中，肝、肾鸡蛋、鱼卵和全奶等。植物则可提供作为维生素等。植物则可提供作为维生素A A元的类胡萝素或胡萝卜素，如元的类
7、胡萝素或胡萝卜素，如菠菜、胡萝卜、红心甘薯菠菜、胡萝卜、红心甘薯、辣椒，以及水果如杏、柿子等。辣椒，以及水果如杏、柿子等。V VD D 人体人体V VD D的主要来源并非食物，而是皮下的主要来源并非食物，而是皮下7-7-脱氢胆固醇经脱氢胆固醇经紫外线照射转变而来。海水鱼的肝脏含量最为丰富。紫外线照射转变而来。海水鱼的肝脏含量最为丰富。6 6 V VE E 具有抗氧化的功能，与机体的抗衰老有关。具有抗氧化的功能，与机体的抗衰老有关。人体所需大多来自谷类于植物油。人体所需大多来自谷类于植物油。V VK K 作用主要是促进肝脏生产凝血酶原，从而具作用主要是促进肝脏生产凝血酶原，从而具有促进凝血作用。
8、绿叶蔬菜含量最为丰富，蛋黄、有促进凝血作用。绿叶蔬菜含量最为丰富，蛋黄、大豆油和猪肝也是良好来源。大豆油和猪肝也是良好来源。7 7n维生素的分析是一项比较复杂的工作。其样品分析维生素的分析是一项比较复杂的工作。其样品分析的一般程序是：的一般程序是：用酸、碱或酶分解样品，使其中用酸、碱或酶分解样品，使其中的维生素游离出来；的维生素游离出来；用溶剂进行提取；用溶剂进行提取；分离干分离干扰物质，对样液进行分离提纯；扰物质，对样液进行分离提纯；用适当的方法进用适当的方法进行定量等。维生素的分析方法很多，选用方法时应行定量等。维生素的分析方法很多，选用方法时应根据样品的品种、类型、待测维生素的性质、含量
9、根据样品的品种、类型、待测维生素的性质、含量以及干扰物质多少等因素来决定。以及干扰物质多少等因素来决定。n下面重点介绍维生素下面重点介绍维生素C C、维生素、维生素B1B1和和B2B2以及作为维生以及作为维生素素A A原的原的-胡萝卜素的测定。胡萝卜素的测定。8 8一、维生素一、维生素C C的测定的测定n维生素维生素C C又称抗坏血酸。又称抗坏血酸。n（1 1）纯品为白色无臭结晶，熔点为）纯品为白色无臭结晶，熔点为190190192192。n（2 2）溶于水或乙醇中，不溶于油剂。）溶于水或乙醇中，不溶于油剂。n（3 3）在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，）在水溶液中易被氧化，在碱性条件下
10、易分解，在弱酸条件下较稳定。在弱酸条件下较稳定。9 910101111n总抗坏血酸包括总抗坏血酸包括还原型还原型、氧化型抗坏血酸和氧化型抗坏血酸和2,3-2,3-二二酮古乐糖酸酮古乐糖酸。nVcVc测定主要有：测定还原型测定主要有：测定还原型VcVc和氧化型和氧化型VcVc的总含量的总含量（如荧光法，（如荧光法，2,42,4二硝基苯肼法二硝基苯肼法、高效液相色谱、高效液相色谱法等法等)及还原型及还原型VcVc测定法测定法(2,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法，电位滴定法，碘滴定法，钼蓝比色法，碘酸钾萃取电位滴定法，碘滴定法，钼蓝比色法，碘酸钾萃取分光光度法等分光光度法等)两类两类,其中其中
11、有些方法既可测定有些方法既可测定VcVc全全量量,也可测定还原型也可测定还原型VcVc,如酶法。如酶法。1212n高效液相色谱法、荧光法要求样品的纯度较高，高效液相色谱法、荧光法要求样品的纯度较高，高效液相色谱法可以同时测得高效液相色谱法可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗抗坏血酸和脱氢抗坏血酸坏血酸的含量，具有干扰少，准确度高，重现性的含量，具有干扰少，准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速等优点，是上述几种方法好，灵敏、简便、快速等优点，是上述几种方法中最先进、可靠的方法，但需要有昂贵的仪器，中最先进、可靠的方法，但需要有昂贵的仪器，目前尚无法普遍采用。目前尚无法普遍采用。1313n2.6-2.6
12、二靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该二靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其他法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其他还原性物质还原性物质(如如FeFe2+2+、SnSn2+2+、CuCu2+2+等等)会干扰测定，会干扰测定，使测定值偏高。对深色样液滴定终点不易辨别，使测定值偏高。对深色样液滴定终点不易辨别，如山楂，树莓，草莓等如山楂，树莓，草莓等 。1414n2,4-2,4-二硝基苯肼比色法和荧光法测得的是抗坏血二硝基苯肼比色法和荧光法测得的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量，操作麻烦，耗时较长。酸和脱氢抗坏血酸的总量，操作麻烦，耗时较长。n但也易受色
13、素影响但也易受色素影响,当待测液本身有颜色时当待测液本身有颜色时,消光消光值会受到影响值会受到影响,从而影响到测定结果的准确性。从而影响到测定结果的准确性。1515n钼蓝比色法则不然钼蓝比色法则不然,该法不易受样品提取液颜色的该法不易受样品提取液颜色的影响。影响。n紫外分光光亮法是操作简便，不受样品提取液颜色紫外分光光亮法是操作简便，不受样品提取液颜色的影响，但是重复间偏差较大的影响，但是重复间偏差较大 。n碘滴定法不适于花青素含量高的果蔬样品碘滴定法不适于花青素含量高的果蔬样品VcVc测定。测定。16161717181819192020（一）还原型维生素（一）还原型维生素C C的测定的测定n
14、维生素维生素C C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成一步水解则生成2 2，3-3-二酮古乐糖酸，失去生理作二酮古乐糖酸，失去生理作用用。在食品中，这三种形式均有存在，但主要是。在食品中，这三种形式均有存在，但主要是前两者，故许多国家的食品成分表均以抗坏血酸前两者，故许多国家的食品成分表均以抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示。和脱氢抗坏血酸的总量表示。21212222n1 1、方法原理、方法原理 抗坏血酸抗坏血酸(VcVc)结构中有结构中有烯二醇烯二醇存在，因此具
15、有存在，因此具有还原性还原性，能，能将将蓝色染料蓝色染料2 2，6-6-二氯靛酚还原为无色的化合物二氯靛酚还原为无色的化合物，VcVc则被则被氧化为脱氢氧化为脱氢VcVc，反应式如下：，反应式如下：2323n2,6-2,6-二氯靛酚具有二氯靛酚具有酸碱指示酸碱指示及及氧化还原氧化还原指示的两种指示的两种特性。氧化态时呈特性。氧化态时呈深蓝色深蓝色(碱介质中碱介质中)或或浅红色浅红色(酸性酸性介质介质，变色范围，变色范围pH4pH45)5)，还原态时为，还原态时为无色无色。n根据这个特性用碱性蓝色染料的标准溶液滴定植根据这个特性用碱性蓝色染料的标准溶液滴定植物样品酸性浸出液中物样品酸性浸出液中V
16、cVc到刚变到刚变浅红色浅红色为终点，由染为终点，由染料的用量即可计算料的用量即可计算VcVc的含量。的含量。n滴定终点的红色是滴定终点的红色是刚过量刚过量的的未被还原未被还原的的(氧化型氧化型)染染料溶液在料溶液在酸性介质酸性介质中的颜色。中的颜色。24242 2、注释、注释（1 1）偏磷酸是偏磷酸是VcVc的最佳稳定剂，且具有沉淀蛋白质的的最佳稳定剂，且具有沉淀蛋白质的作用作用。但其。但其价格较贵价格较贵，在室温下放置，在室温下放置易转化为正磷易转化为正磷酸酸，降低对，降低对VcVc的稳定性。草酸廉价易得的稳定性。草酸廉价易得,有与磷酸相有与磷酸相近的稳定性。而醋酸适于浸提含有近的稳定性。
17、而醋酸适于浸提含有FeFe2+2+的样品。的样品。n根据根据VcVc在酸性溶液中相对较稳定这一特性，历来采在酸性溶液中相对较稳定这一特性，历来采用的提取剂都是各种各样的酸性溶液用的提取剂都是各种各样的酸性溶液,现在一般采用现在一般采用的主要是的主要是2%2%偏磷酸偏磷酸、2%2%草酸溶液草酸溶液，其次是，其次是8%8%醋酸醋酸、10%10%三氯乙酸三氯乙酸及及偏磷酸偏磷酸-醋酸混合液醋酸混合液。252526262727n(2)(2)所用的提取剂所用的提取剂草酸草酸、标定、标定VcVc用的用的碘酸液碘酸液以及以及标准标准VcVc液液均均不稳定，须避光、低温不稳定，须避光、低温保存。碘酸液以贮备保
18、存。碘酸液以贮备液保存（较高浓度，液保存（较高浓度，0.1mol0.1molL L-1-1）。）。VcVc临用临配，临用临配，不能加热配制不能加热配制。n(3)(3)样品采取后，样品采取后，应浸泡在已知量的应浸泡在已知量的2 2草酸溶液中草酸溶液中，以防止抗坏血酸氧化损失。测定时整个操作过程要以防止抗坏血酸氧化损失。测定时整个操作过程要迅速，防止抗坏血酸被氧化。迅速，防止抗坏血酸被氧化。2828n(4)4)KIOKIO3 3与还原与还原VcVc的主要反应如下：的主要反应如下：n从上述反应式可知从上述反应式可知1mol(1/6KIO1mol(1/6KIO3 3)与与1mol(1/2C1mol(1
19、/2C6 6H H8 8O O6 6)完全反应，故完全反应，故1/2C1/2C6 6H H8 8O O6 6的摩尔质量为的摩尔质量为88gmol88gmol-1-1。2929n(5)(5)2,6-2,6-二氯靛酚固体试剂有时含有分解产物，染料二氯靛酚固体试剂有时含有分解产物，染料溶液长久贮存时也会生成分解主物，从而使滴定终溶液长久贮存时也会生成分解主物，从而使滴定终点不敏锐，点不敏锐，因此应在使用前检查因此应在使用前检查。n检查方法：检查方法：取取15mL15mL染料溶液加入过量的染料溶液加入过量的VcVc溶液，若溶液，若还原后的溶液带有颜色，表示此溶液已不能使用。还原后的溶液带有颜色，表示此
20、溶液已不能使用。n保存在保存在棕色瓶和冰箱棕色瓶和冰箱中。中。3030n(6)(6)使用白陶土时，要对每批新的白陶土测定对使用白陶土时，要对每批新的白陶土测定对VcVc的的回收率。回收率。n(7)(7)样品中可能有其它还原性物质也可使染料还原。样品中可能有其它还原性物质也可使染料还原。但其还原染料的速度较慢，故但其还原染料的速度较慢，故滴定终点以浅红色在滴定终点以浅红色在15s15s不褪色为准不褪色为准。n(8)(8)本法适用于本法适用于测定还原型抗坏血酸测定还原型抗坏血酸，不适于有亚铁、，不适于有亚铁、亚锡、亚铜、亚硫酸盐或硫代硫酸盐共存的样品。亚锡、亚铜、亚硫酸盐或硫代硫酸盐共存的样品。3
21、131n(9)(9)样品切碎、缩分及称量等过程会使样品切口接样品切碎、缩分及称量等过程会使样品切口接触空气而促进维生素触空气而促进维生素C C氧化，应尽量动作迅速氧化，应尽量动作迅速,VcVc提取液对光敏感，操作室内应设置窗帘，以防加速提取液对光敏感，操作室内应设置窗帘，以防加速VcVc氧化。氧化。n(10)(10)所有试剂最好用重蒸馏水配制。所有试剂最好用重蒸馏水配制。n(11)(11)标定靛酚滴定液时与滴定样品液时，滴定终点标定靛酚滴定液时与滴定样品液时，滴定终点的掌握应严格一致，否则将引起误差。的掌握应严格一致，否则将引起误差。n(12)(12)测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣测
22、定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。除空白体积。3232n(13)(13)VcVc的含量随样品个体或部位的不同差别很大，因此测定的含量随样品个体或部位的不同差别很大，因此测定VcVc时取样的代表性尤为重要。测定样品平均含量时，一般至时取样的代表性尤为重要。测定样品平均含量时，一般至少取均匀个体少取均匀个体5 5个以上，纵切分成个以上，纵切分成4 48 8等分，再分别取对角等分，再分别取对角的的2-42-4片，切碎，充分混合后四分法分取样。片，切碎，充分混合后四分法分取样。n(14)(14)滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作
23、为观察颜色变化的参考。察颜色变化的参考。n(15)(15)在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇辛醇消除。消除。n（1616）还原型还原型VcVc含量（含量（mg.kgmg.kg-1-1）100 100 允许误差（允许误差（mg.kgmg.kg-1-1）5.05.0，100-1000 100-1000 允许允许10.010.03333（二）维生素（二）维生素C C总量的测定总量的测定(2(2，4 4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法)n1 1、方法原理：、方法原理：VcVc总量总量包括还原型包括还原型VcVc、脱氢型、脱氢型VcVc和二酮古乐
24、糖酸和二酮古乐糖酸，将，将样品中的还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，进一样品中的还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，进一步水解为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与步水解为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2,4-2,4-二硝基二硝基苯肼耦联生成红色的脎。其呈色的强度与二酮古乐糖苯肼耦联生成红色的脎。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。酸浓度成正比，可以比色定量。34342 2、操作步骤、操作步骤n称样称样 加等量加等量2%2%草酸草酸 于高速捣碎机捣碎于高速捣碎机捣碎 取匀浆取匀浆20g 20g 用用1%1%草酸定容草酸定容100ml 100ml 过滤过滤 取取滤液滤液10ml 10ml 加
25、加1%1%草酸草酸10ml 10ml 加少量活性炭加少量活性炭 摇摇1 1分钟分钟 静置过滤静置过滤 各取滤液各取滤液2ml2ml于样品管和于样品管和样品空白管样品空白管 各管各管加入加入1 1滴硫脲溶液滴硫脲溶液 于样品管于样品管中中加入加入2 2，4-4-二硝基苯肼二硝基苯肼0.5ml 0.5ml 分别于两个管加分别于两个管加盖盖 于于3737保温箱保温箱3 3小时小时3535n保温箱保温箱3 3小时小时 取出后样品管放入冰水中取出后样品管放入冰水中取出后样品管放入冰水中取出后样品管放入冰水中 样品空样品空样品空样品空白管取出后冷至室温白管取出后冷至室温白管取出后冷至室温白管取出后冷至室温
26、 在样品空白管加入在样品空白管加入在样品空白管加入在样品空白管加入2 2 2 2，4-4-4-4-二二二二硝基苯肼硝基苯肼硝基苯肼硝基苯肼 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 样品管和空白管都于样品管和空白管都于样品管和空白管都于样品管和空白管都于冰浴中冰浴中冰浴中冰浴中 滴加滴加滴加滴加9 9 9 91H1H1H1H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 4 4 2ml 2ml 2ml 2ml于各管中于各管中于各管中于各管中 边滴边摇边滴边摇边滴边摇边滴边摇 防防防防止温度升高炭化后呈黑色止温度升高炭化后呈黑色止温度升高炭化后呈黑色止温度升高炭化后呈黑色 冰浴中取出冰浴中取出冰浴中
27、取出冰浴中取出 室温下室温下室温下室温下放置放置放置放置30303030分钟后分钟后分钟后分钟后，在，在，在，在540nm540nm540nm540nm测测测测消光值，从标准曲线上查消光值，从标准曲线上查消光值，从标准曲线上查消光值，从标准曲线上查出相应的含量。出相应的含量。出相应的含量。出相应的含量。3636n3 3、注意事项、注意事项n（1 1）本法为国家标准方法，适用于蔬菜、水果及其制品中总本法为国家标准方法，适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。抗坏血酸的测定。n（2 2）硫脲可防止硫脲可防止VcVc被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中硫脲的浓
28、度应一致，否则影响色度。硫脲的浓度应一致，否则影响色度。n（3 3）加入加入H H2 2SOSO4 4(9(91)1)溶液后试管从冰水中取出，溶液颜色溶液后试管从冰水中取出，溶液颜色会继续变深，所以必须准确加入会继续变深，所以必须准确加入H H2 2SOSO4 4后后30min30min内比色内比色(糖存糖存在造成显色不稳定在造成显色不稳定,颜色会逐渐加深颜色会逐渐加深)。3737n(4)(4)活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低，加入量过高，对抗
29、坏血酸有吸附作测定结果偏低，加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，使结果也偏低。用，使结果也偏低。n活性炭须活性炭须充分酸化充分酸化，才能有，才能有较强的氧化能力较强的氧化能力，且具，且具有有除色素除色素的双重作用。的双重作用。n1mol1molL L-1-1HCl,100gHCl,100g于于750ml750ml，煮沸，煮沸1-2h1-2h，沸水洗涤至，沸水洗涤至无无FeFe2+2+，烘干。，烘干。3838n(5)(5)2,4-2,4-二硝基苯肼和氧化型二硝基苯肼和氧化型VcVc藕联形成脎在藕联形成脎在脱水氧化环境脱水氧化环境下才稳定。下才稳定。n(6)(6)溶液中其他的酮和酮衍生物和溶液中其他
30、的酮和酮衍生物和2,4-2,4-二硝基苯肼也形成脎，二硝基苯肼也形成脎，故故须作空白试验须作空白试验（指没有（指没有VcVc参与下形成脎的量）。参与下形成脎的量）。n(7)(7)硫脲可防止抗坏血酸继续氧化，同时促进脎的形成。硫脲可防止抗坏血酸继续氧化，同时促进脎的形成。最后最后溶液中硫脲的浓度要一致溶液中硫脲的浓度要一致，否则影响测定结果。，否则影响测定结果。3939n(8)(8)测定波长一般在测定波长一般在495495540nm540nm，样品杂质多时在，样品杂质多时在540nm540nm较合适，但灵敏度较最大吸收波长较合适，但灵敏度较最大吸收波长(520nm)(520nm)下下的灵敏度降低
31、的灵敏度降低3030。n(9)(9)加加9:19:1硫酸溶液时，为防止溶液中的糖炭化而变硫酸溶液时，为防止溶液中的糖炭化而变黑色，需黑色，需边滴加边摇边滴加边摇试管。试管。4040二、维生素二、维生素B B1 1、B B2 2 测定测定nV VB1B1又叫硫胺素，又叫硫胺素，V VB1B1是一种重要的维持人体代谢平衡是一种重要的维持人体代谢平衡的物质的物质,缺乏时可能引起脚气病、多发性神经炎等疾缺乏时可能引起脚气病、多发性神经炎等疾病。病。nV VB1B1存在于糙米、酵母、谷类、肝、肉类、豆类及其存在于糙米、酵母、谷类、肝、肉类、豆类及其他动植物组织中，动物组织不如植物含量丰富。他动植物组织中
32、动物组织不如植物含量丰富。n测定测定V VB1B1的方法有重量法、滴定法、荧光法、电位法的方法有重量法、滴定法、荧光法、电位法及示波电位滴定法等。及示波电位滴定法等。n世界各国都用荧光法测定。世界各国都用荧光法测定。4141（一）（一）V VB1B1的性质的性质n V VB1B1在中性、碱性下不稳定，易分解；在中性、碱性下不稳定，易分解；n V VB1B1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；n V VB1B1为白色结晶，微溶于为白色结晶，微溶于C C2 2H H5 5OHOH，不溶于乙醚或，不溶于乙醚或CHClCHCl3 3，易溶于水。，易溶于水。42
33、42（二）（二）V VB2B2 （核黄素）的性质（核黄素）的性质n V VB2B2在中性水里溶解极少，呈黄绿色的荧光，在强酸性和强在中性水里溶解极少，呈黄绿色的荧光，在强酸性和强碱性溶液中则充分溶解。碱性溶液中则充分溶解。n(2)(2)橙黄色针状结晶，熔点为橙黄色针状结晶，熔点为282282的，耐热，对空气、氧气的，耐热，对空气、氧气稳定。稳定。n测定测定V VB2B2的方法有的方法有光黄素荧光法光黄素荧光法、核黄素荧光法核黄素荧光法、高效液相色、高效液相色谱法。谱法。光黄素荧光法光黄素荧光法灵敏度和精密度都较高，适用于测定农灵敏度和精密度都较高，适用于测定农产品中的产品中的V VB2B2 。
34、高效液相色谱法测定维生素具有简便、快速，。高效液相色谱法测定维生素具有简便、快速，可同时进行多种水溶性维生素测定等优点，是近年发展较快可同时进行多种水溶性维生素测定等优点，是近年发展较快的测定方法的测定方法。4343（三）（三）V VB1B1和和V VB2B2的测定（液相色谱法）的测定（液相色谱法）n n1 1 1 1、方法原理：、方法原理：、方法原理：、方法原理：样品在稀盐酸溶液中经消化，用样品在稀盐酸溶液中经消化，用样品在稀盐酸溶液中经消化，用样品在稀盐酸溶液中经消化，用淀粉淀粉淀粉淀粉酶酶酶酶和和和和木瓜酶分解木瓜酶分解木瓜酶分解木瓜酶分解样液中的淀粉和蛋白质后，即得到样液中的淀粉和蛋白
35、质后，即得到样液中的淀粉和蛋白质后，即得到样液中的淀粉和蛋白质后，即得到V VB2B2的测定样液。的测定样液。的测定样液。的测定样液。n n此溶液在此溶液在此溶液在此溶液在碱性铁氰化钾碱性铁氰化钾碱性铁氰化钾碱性铁氰化钾溶液中溶液中溶液中溶液中氧化氧化氧化氧化后用后用后用后用异丁醇提取异丁醇提取异丁醇提取异丁醇提取所得所得所得所得V VB1B1测定样液。测定样液。测定样液。测定样液。n n然后用然后用然后用然后用YWG-CYWG-CYWG-CYWG-Cl8l8l8l8柱柱柱柱,乙腈磷酸盐缓冲溶液作流动相，乙腈磷酸盐缓冲溶液作流动相，乙腈磷酸盐缓冲溶液作流动相，乙腈磷酸盐缓冲溶液作流动相，以以以
36、以荧光检测器荧光检测器荧光检测器荧光检测器进行液相色谱法测定，求出样品中进行液相色谱法测定，求出样品中进行液相色谱法测定，求出样品中进行液相色谱法测定，求出样品中V VB1B1和和和和V VB2B2的含量。的含量。的含量。的含量。44442 2、操作步骤、操作步骤n(1)(1)样品处理样品处理 固体样品粉碎过固体样品粉碎过2020目筛，果蔬、肉类及水产品经捣碎备用。目筛，果蔬、肉类及水产品经捣碎备用。n称取试样称取试样1.00g(1.00g(V VB1B1和和V VB2B2含量不低于含量不低于0.5g)0.5g)于于50mL50mL棕色容量瓶棕色容量瓶中，加入中，加入0.1molL0.1mol
37、L-1-1盐酸溶液盐酸溶液35ml35ml，在超声波浴中超声，在超声波浴中超声3min3min或或转动摇匀，在高压灭菌锅内转动摇匀，在高压灭菌锅内121121保持保持202030min30min或置于沸水浴或置于沸水浴中加热中加热30min30min，然后轻摇数次，取出，冷却至，然后轻摇数次，取出，冷却至4040以下，分别以下，分别加混合酶液各加混合酶液各2.5mL2.5mL，摇匀，置于，摇匀，置于3737下过夜或下过夜或42424343加热加热4h4h，冷却，用水定容。样液经，冷却，用水定容。样液经3000r/min3000r/min速度离心过滤，取约速度离心过滤，取约10ml10ml，滤液
38、备用。然后取滤液直接进行，滤液备用。然后取滤液直接进行V VB2B2测定。测定。4545n取上述滤液取上述滤液5ml5ml于于60ml60ml分液漏斗中，沿分液漏斗壁加碱性铁分液漏斗中，沿分液漏斗壁加碱性铁氰化钾溶液氰化钾溶液3ml(3ml(边摇边加边摇边加)，继续振摇，继续振摇10s10s，立即加入异丁，立即加入异丁醇醇8ml8ml，并猛烈振摇，并猛烈振摇45s45s静置分层后弃去水层。静置分层后弃去水层。n有机相通过无水硫酸钠小柱，其收集液为有机相通过无水硫酸钠小柱，其收集液为V VB1B1待测液。待测液。n(2)(2)标准溶液制备。标准溶液制备。准确吸取准确吸取2mgL2mgL-1-1
39、V VB1B1和和V VB2B2混合工作液混合工作液0 0、0.250.25、0.500.50、1.001.00、2.002.00、4.00ml4.00ml，于，于50ml50ml棕色容量中，再棕色容量中，再加入与样品等量的加入与样品等量的0.1 molL0.1 molL-1-1盐酸，以下操作同样品处理，盐酸，以下操作同样品处理，得到得到V VB2B2标准系列水溶液和标准系列水溶液和V VB1B1标准系列异丁醇溶液。标准系列异丁醇溶液。n(3)(3)样品测定。样品测定。4646n n4 4、注释、注释n（1 1）V VB2B2测定用消化后的滤液直接进样，处理后的标测定用消化后的滤液直接进样，处
40、理后的标准和样品都有杂质峰，但能分离准和样品都有杂质峰，但能分离V VB2B2，不影响测定。，不影响测定。n（2 2）由于由于V VB1B1被碱性铁氰化钾氧化并不是定量产生硫被碱性铁氰化钾氧化并不是定量产生硫色素，但在恒定条件下是一个恒量。用异丁醇萃取的色素，但在恒定条件下是一个恒量。用异丁醇萃取的V VB1B1也是如此。因此也是如此。因此本法采取等体积进样本法采取等体积进样。n（3 3）样品处理是能否获得满意结果的关键。样品处理是能否获得满意结果的关键。4747n（4 4）液相色谱仪需有）液相色谱仪需有：a.a.荧光分光光度检测器及记录仪；荧光分光光度检测器及记录仪；b.b.色谱柱色谱柱n（
41、5 5）V VB1B1和和V VB2B2测定时所用的流动相不同。测定时所用的流动相不同。nV VB1B1：用流动相：用流动相A A，以磷酸盐缓冲液，以磷酸盐缓冲液8080份份（0.025 0.025 molLmolL-1-1磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，pHpH7.47.4）和乙腈和乙腈2020份相混而成；份相混而成；nV VB2 B2：流动相：流动相B B，以磷酸盐缓冲液，以磷酸盐缓冲液8282份和乙腈份和乙腈1818份混份混合而成。合而成。4848n n（6 6 6 6）碱性铁氰化钾溶液。吸取碱性铁氰化钾溶液。吸取碱性铁氰化钾溶液。吸取碱性铁氰化钾溶液。吸取150g150g150g150gL L
42、1-1氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液97mL97mL97mL97mL加入加入加入加入10g10g10g10gL L-1-1铁氰化钾铁氰化钾铁氰化钾铁氰化钾3mL3mL3mL3mL混合而成。混合而成。混合而成。混合而成。n n混合酶溶液（淀粉酶和木瓜酶各混合酶溶液（淀粉酶和木瓜酶各混合酶溶液（淀粉酶和木瓜酶各混合酶溶液（淀粉酶和木瓜酶各3g3g3g3g，用，用，用，用2 2 2 2molLmolL-1-1醋酸钠稀释醋酸钠稀释醋酸钠稀释醋酸钠稀释至至至至100mL100mL100mL100mL）n n（7 7 7 7）测时时仪器条件（参考）测时时仪器条件（参考）测时时仪器条件（
43、参考）测时时仪器条件（参考）n n VB1VB1VB1VB1：激发波长：激发波长：激发波长：激发波长435nm435nm435nm435nm，狭缝为，狭缝为，狭缝为，狭缝为10nm10nm10nm10nm，发射波长为，发射波长为，发射波长为，发射波长为375nm375nm375nm375nm，狭，狭，狭，狭缝为缝为缝为缝为12.5nm12.5nm12.5nm12.5nm，灵敏度，灵敏度，灵敏度，灵敏度10101010。n n VB2VB2VB2VB2：激发波长：激发波长：激发波长：激发波长440440440440，发射波长为，发射波长为，发射波长为，发射波长为565565565565,狭缝为狭
44、缝为狭缝为狭缝为12.5nm12.5nm12.5nm12.5nm，灵敏，灵敏，灵敏，灵敏度度度度3,3,3,3,其他同其他同其他同其他同VB1VB1VB1VB1。49495050515152525353545455555656三、纸层析法测定三、纸层析法测定胡萝卜素胡萝卜素n胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，也含有胡萝卜素。胡萝卜素的食品，也含有胡萝卜素。n胡萝卜或浓缩胡萝卜汁中胡萝卜素含量的多少是评价其品
45、质胡萝卜或浓缩胡萝卜汁中胡萝卜素含量的多少是评价其品质优劣的重要指标和开发利用的主要依据。优劣的重要指标和开发利用的主要依据。n胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因属于脂溶性维生素，故可用有机溶剂从促进其氧化破坏。因属于脂溶性维生素，故可用有机溶剂从农产品中提取农产品中提取。5757n胡萝卜素是具有类似维生素胡萝卜素是具有类似维生素A A的生物活性和效力的物的生物活性和效力的物质，称维生素质，称维生素A A原。胡萝卜素常有原。胡萝卜素常有、几种异几种异构体，其中以构体，其中以胡萝卜素的生理效能最大。在动物胡萝
46、卜素的生理效能最大。在动物的小肠内、肝脏中转化为维生素的小肠内、肝脏中转化为维生素A A。结构式如下：。结构式如下：5858n-胡萝卜素是植物色素，存在于谷物、蔬菜、水果等食物中。胡萝卜素是植物色素，存在于谷物、蔬菜、水果等食物中。以每百克可食部分计，小米以每百克可食部分计，小米0.12mg0.12mg、玉米、玉米0.34mg0.34mg、玉米面、玉米面0.13mg0.13mg、黄豆、黄豆0.40mg0.40mg、黄豆粉、黄豆粉0.48mg0.48mg、绿豆、绿豆0.22mg0.22mg、毛豆、毛豆0.23mg.0.23mg.n 因因-胡萝卜素是有色色素，可采用直接比色法定量分析。胡萝卜素是有
47、色色素，可采用直接比色法定量分析。n但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取提取胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其他色素分开。在测定前，必须将胡萝卜素与其他色素分开。5959n目前测定胡萝卜素的方法主要有以下几种目前测定胡萝卜素的方法主要有以下几种:纸层析法纸层析法;薄层层析法薄层层析法;柱层析法柱层析法;分光光度法分光光度法;高效液相色谱法或液质联用法。高效液相色谱法或液质联用法。60606161n纸层析法：是一种操作方便且易于掌握，同时可测纸
48、层析法：是一种操作方便且易于掌握，同时可测定多种样品，测定结果具有较高的准确度和精密度，定多种样品，测定结果具有较高的准确度和精密度，线性相关极显著，不需要特定的设备，成本较低，线性相关极显著，不需要特定的设备，成本较低，适合条件较简陋，普通实验室均可采用的测定适合条件较简陋，普通实验室均可采用的测定-胡胡萝卜素含量的方法。萝卜素含量的方法。6262(一一)纸层析的原理纸层析的原理n根据固定相的形式把固定相装于管子中的色谱称为根据固定相的形式把固定相装于管子中的色谱称为柱色谱，柱色谱，把固定相成平面板状的色谱称为平板色谱，把固定相成平面板状的色谱称为平板色谱，如纸层析、薄层层析。如纸层析、薄层
49、层析。n纸层析是以滤纸纤维及其结合水形成的复合物作为纸层析是以滤纸纤维及其结合水形成的复合物作为固定相。将待分离的样品溶液点在滤纸的一端，在固定相。将待分离的样品溶液点在滤纸的一端，在密闭的容器中，用适宜的溶剂密闭的容器中，用适宜的溶剂(展开剂展开剂)作为流动相，作为流动相，带动样品斑点，从滤纸的一端向另一端迁移，此称带动样品斑点，从滤纸的一端向另一端迁移，此称为展开。为展开。6363n由于样品中，各组分与滤纸亲和力的强弱差异，及在展由于样品中，各组分与滤纸亲和力的强弱差异，及在展开剂中溶解度的大小不同，在展开过程中，经过反复的开剂中溶解度的大小不同，在展开过程中，经过反复的吸附、解吸，经一定
50、时间产生吸附、解吸，经一定时间产生差速迁移差速迁移，使样品中各组，使样品中各组分得以分离。经显色剂显色，可在滤纸上看到分离的斑分得以分离。经显色剂显色，可在滤纸上看到分离的斑点。这些斑点就是通常所说的色谱。点。这些斑点就是通常所说的色谱。n在两相中，吸附力强、溶解度大的组分，迁移速度快，在两相中，吸附力强、溶解度大的组分，迁移速度快，斑点离原点距离就大，反之距离就小。斑点离原点距离就大，反之距离就小。各组分在滤纸中各组分在滤纸中的位置，可用比移值的位置，可用比移值RfRf来表示。根据来表示。根据RfRf值可以定性，根值可以定性，根据斑点大小及颜色深浅可以定量。据斑点大小及颜色深浅可以定量。64
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