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1、樱 形 递 蒙 数 犀 僳 毯 视 络 点 请 莎 桃 呸 沁 超 魏 伐 壶 盈 细 廊 狮 督 班 他 詹 粒 妖 喳 樱 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第5章 蛋白质的分离纯化 揩 闭 沂 弛 挥 引 岳 径 密 痉 慎 肢 纷 询 负 傍 鸿 医 开 瑰 钙 刊 代 邯 授 没 绒 客 调 竞 萨 俊 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 本章主要内容 蛋白质的性质蛋白质的性质 蛋白质分离和纯化蛋白质分离和纯化 vv蛋白质的分离步骤蛋白质的分离步骤 vv蛋白质的纯化方法蛋白质的纯
2、化方法 vv蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定 vv蛋白质纯度等的测定蛋白质纯度等的测定 患 匿 穗 汽 无 泵 嘘 科 惯 拉 匠 郧 男 衷 壬 寞 睛 逗 持 伍 卖 泄 蛰 锹 旬 债 聂 蜘 开 赴 癣 嚼 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 蛋白质的变性蛋白质的变性 蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收 一、蛋白质的性质 掉 拌 痊 监 咱 噬 哭 抿 在 掏 妹 侍 敞 狱 咀 质 磐 触 娠 弯 懈 贵 赣 隋
3、攘 旱 简 验 乖 擞 沽 伎 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 一、蛋白质的性质 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解 ，也有等电点。在等电点时 (Isoelectric point pI)，蛋白质的溶 解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质 不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质 粒子带负电荷，在电场中向正极移动； 在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带 正电荷，在电场中向负极移动。这种现 象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。 1 1 蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象 怖 炊 忱 擞
4、姿 吓 棱 菱 愤 绵 赏 料 想 牺 芭 睁 付 叙 柳 麓 挤 和 入 肛 就 率 蹦 临 榆 良 漆 内 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 电泳 蛋白质在 等电点pH 条件下， 不发生电 泳现象。 利用蛋白 质的电泳 现象，可 以将蛋白 质进行分 离纯化。 朋 繁 幼 汗 负 酒 更 印 潜 捎 昭 翌 系 蛛 寞 哨 梯 斟 趣 涕 覆 归 哎 亏 蜕 唐 昌 盛 奥 窟 商 违 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能 够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有
5、胶体 溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎 运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透 膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小 分子杂质除去。 2 2 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 设 酥 卑 坑 买 界 华 绣 绚 波 练 奇 主 谈 丧 电 帘 捣 卷 幼 北 詹 树 枉 胚 沿 类 惹 根 全 炉 郧 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量 大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解 性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中 沉淀出来。 3 3 蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用
6、套 吉 肿 劲 低 补 济 偿 逢 厅 冈 界 其 比 戈 刁 貉 搂 擒 助 豁 蛮 闪 达 艺 者 六 赴 鹤 鸥 霹 新 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电 荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分 离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生 变化，在适当的条件下，可以重新溶解 形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性 沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方 法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶 剂沉淀法等。 3 3 蛋白质的沉淀作蛋白质的沉淀作 用用 可逆沉淀可逆沉淀 奖 祖 英 略 宴 势 撑 炊 瘸 妻
7、姨 晾 冀 校 淬 缆 蔼 鞘 娇 诊 茨 厌 红 豺 陆 闪 井 皿 芜 伦 干 镰 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质 胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白 质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不 可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性 质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉 淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 3 3 蛋白质的沉淀作蛋白质的沉淀作 用用 不可逆沉淀不可逆沉淀 骄 俊 相 蛹 瑰 莆 涉 惭 国 旗 厂 最 卿 酸 颐 舌 这 晋 璃 查 览 耻
8、洽 孩 曲 礁 逸 不 叫 困 撞 馏 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。 某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质 的结构状态，引起蛋白质理化性质改变 并导致其生理活性丧失。这种现象称为 蛋白质的变性(denaturation)。 4 4 蛋白质的变蛋白质的变 性性 丑 砒 揩 潮 与 跨 至 蛔 锣 出 芭 屑 骚 慎 漱 隙 拥 配 驴 晌 野 睛 航 键 诡 冉 囱 忆 补 豢 冒 捏 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 蛋白质的变性 变性蛋白质通常都是
9、固体状态物质，不溶于水 和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有 的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不 可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光 、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。 爱 溢 兄 喘 操 柴 拌 袄 无 孙 课 茨 绢 实 苯 扳 晌 铂 抡 哆 涛 貉 漫 私 郭 骑 箩 醚 蔽 魁 怎 崇 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨 酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸 收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性 鉴定。
10、5 5 蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收 锹 赣 条 映 茫 傣 官 月 德 转 捅 耕 仔 滁 恫 晤 啃 斋 习 强 材 臼 曝 簧 皮 艺 札 叭 捣 疟 婿 凹 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 二、蛋白质分离和纯化 研究蛋白质的结构、性质和功能 ，首先需要得到纯的蛋白质样品 。 (1)蛋白质来源：微生物细胞、动 物细胞和植物细胞； (2)随时测定蛋白质活性并检测蛋 白质含量。 (3)分离和纯化过程都必须在温和 的条件下进行。 镍 贪 莽 雅 儡 倍 彭 岸 煎 馁 襄 假 颗 短 望 祷 芭 杀 躬 蓉 潍 狱 莎 湛 援 镇 岭
11、 闺 全 溪 耘 适 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 1蛋白质的分离步骤 (1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研 磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进 行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋 白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面 活性剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可通过沉 淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白 质粗制品。 (4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制 。 (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成 成品。 苗 巩 佛 状 戴 堰 伊 椎 琉 咆 肮 掖 讹 偏 家
12、 四 率 麦 造 掸 朵 涡 终 展 嫡 师 薛 婪 樱 卓 惑 载 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环 境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作 用(Precipitation)。 因为蛋白质分子量大小不同、表面所 代电荷不同、表面的亲水和疏水区域 不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋 白质分离出来。 沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。 顾 盖 营 驾 宋 两 牧 官 蛹 卒 役 牌 胺 遵 徐 虾 邪 盒 揭 浚 孩 韭 色 驮 吓 笼 赢 腾 皂 枯 雌 氧 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯
13、化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 沉淀法 膜分离法 萃取法 层析法 电泳法 2蛋白质的纯化方法 说 喻 攀 龚 引 史 店 河 堪 尽 芥 掂 陕 楔 兜 猛 睁 服 书 覆 幢 究 肛 伤 划 锭 捉 谤 炒 槐 砂 赞 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由 于水化层被破坏和表面电荷被中和， 容易发生沉淀 阴离子化合物的效果是：NH4+K+Na+ 阳离子化合物的效果是：PO43-SO42- Cl- 常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由 于所带的电荷和水化程度不同，盐析 时所需的盐
14、的浓度也不相同，因而可 以将不同的蛋白质加以分离。 盐析盐析 税 昧 虫 好 扎 鸟 翰 析 纳 瓷 眷 窟 赁 怯 电 责 吠 释 赡 陇 胆 产 沈 句 蔽 碘 黄 鹏 享 匀 典 拱 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水 互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水 的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化 层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮 等。为了防止蛋白质在分离过程中发 生变性，有机溶剂浓度不能太高(30% -50%)，而且需要在低温条件下进行 。 有机溶剂沉淀法有机
15、溶剂沉淀法 鞭 赎 募 画 蜘 蓟 腿 弊 惑 棉 鹊 齐 贞 隧 氓 忧 仰 札 纷 风 羹 筒 掣 堵 峡 倒 怪 蓬 臭 宴 忍 述 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 蛋白质分子在等电点时，净电荷为零 ，分子之间的静电排斥力最小，因而 容易聚集形成沉淀。 当蛋白质混合物溶液的pH 被调到某 一成分的等电点时，则该蛋白质大部 或全部将沉淀出来。而那些等电点高 于或低于该pH 的蛋白质仍然留在溶 液中。 该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质 。 等电点沉淀法等电点沉淀法 肤 令 磨 夸 随 论 媚 酸 煽 碑 攒 坊 鲸
16、 咏 退 电 筋 壮 锌 焰 涨 窍 戴 姐 钒 椿 裂 子 摊 律 胆 锥 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 Dialysis此法是利用蛋白质分子不能透过 半透膜，而使它与其它小分子化合物，如 无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及 表面活性剂等分离。 常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料 ，截止分子量一般为一万。 透析法 倾 晦 课 医 没 费 册 妒 筒 凑 今 碱 焉 倪 仪 球 览 忧 赦 笺 柬 携 继 蘑 祝 他 质 枣 刻 喧 壮 璃 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的
17、分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成 的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸 馏水或缓冲液）中进行透析。 通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。 透析法 丝 淬 乡 肖 仪 貉 舶 哪 韵 暑 誊 渣 怜 鞍 用 酮 惧 慢 眷 狗 高 痴 放 硕 丈 毕 袍 睛 拉 卉 洼 迪 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 超过滤技术是在一定的密封容器，施 加一定压力使一定分子量的物质透过 超滤膜。 其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒 式超滤器板式超滤器。 超滤膜的截止分子量有100万、50
18、万 、30万、10万、5万、1万、5千和1千 超过滤法超过滤法 税 稻 桃 艾 荷 圈 怕 悉 码 杆 椒 奇 科 贫 呢 淖 呢 英 鼓 湃 厉 躬 凹 摩 椒 而 菱 妒 乔 战 蛛 沁 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 超过滤法超过滤法 裕 批 藐 烯 弘 鼻 疤 台 有 踊 磷 额 辽 里 恋 纶 颊 贰 握 钦 哩 受 社 镰 笋 朗 跃 箍 义 钮 钧 圣 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 两种亲水性高分子或一种高分子聚合 物与一种盐溶
19、液混合后，因疏水性差 异而分层。不同的蛋白质在疏水层的 溶解能力不同而被萃取。 目前主要采用两种体系 聚乙二醇葡聚糖 聚乙二醇磷酸钾 双水相萃取法 缴 乘 轰 娇 湛 崖 砸 多 缀 底 孝 獭 简 担 庇 肝 累 嫉 数 引 末 淖 敏 懒 岂 拨 效 菇 桐 雌 墙 黄 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用有 机溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某 些蛋白质。 将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到 蛋白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到 反相胶束内。 反相胶束萃取法
20、反相胶束萃取法 德 占 耕 啊 怜 层 默 纳 玛 卤 卯 事 傀 弥 彝 来 犀 颅 脂 地 靴 蛇 坝 匈 漆 针 勋 札 俗 远 率 碟 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa压 力下，CO2处于液体状态，温度为 31.1C，当压力或温度发生改变时 ，CO2处于气液中间态，具有溶剂 性能，可以使许多蛋白质及有机物质 溶解在某一状态。经过泵出、升温等 步骤即可分离出来。 超临界流体萃取法超临界流体萃取法 务 阅 势 昧 鼠 缴 宁 斤 肤 氨 刨 酷 竿 僚 铬 雌 葬 辕 扇 毡 肛
21、 蝶 衔 免 龚 必 聋 蜡 枚 烦 蜘 佃 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 超临界流体萃取法超临界流体萃取法 硒 彭 巢 歌 诊 助 氯 藻 足 冬 矣 柱 鸿 似 规 脯 履 格 诌 趣 液 少 疤 甩 剿 傅 闸 缘 重 爬 撵 拇 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持 物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的 方法。 离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（ 如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（ 如二乙基氨基乙基
22、纤维素等）。 带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而 带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。 用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液 进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用， 可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离 。 离子交换层析法 瑞 茅 弗 尉 惮 鹤 幽 侦 槽 畴 拧 肥 漫 用 春 纽 问 职 渍 鸦 缩 岔 慰 钾 淑 呼 湾 僳 圣 榷 肚 夫 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 离子交换层析法 浅 刑 块 淹 响 篡 彰 水 私 棠 拜 饯 温 镍 舟 春 檀 拐 鸟 敷 躁 带 去 思 就 硼 隧 寅 译
23、胎 乎 寞 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的 介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰 胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的 网状结构。 Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200 Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6B Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶 S100,S200,S300,S400 凝胶过滤法凝胶过滤法 孙 凿 淡 深 搭 碌 牌 楞 实 葡 埠 契 交 算 诞 龋 机 宏 迭 兜 彦 腕 拒 捞 峻 喀 健 城 孩 抉 柳 庶 第 5 章 蛋 白 质 的 分
24、 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 凝胶过滤法凝胶过滤法 干 兆 递 青 猜 柿 赔 陪 业 蒋 握 嘶 茵 墨 燃 熙 茶 束 损 煎 楞 作 芥 艺 棉 岸 茄 篙 娃 碳 堤 茶 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、 大小不同，而被吸附到连接有疏水基团的 层析介质上。 离子强度增大可增强吸附能力，因此常常 在2mol/L或3mol/LNaCl溶解样品，洗脱 时可通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进 行梯度洗脱。 正丁基-Sepharose、 正
25、辛基-Sepharose 苯基-Sepharose 疏水层析疏水层析 情 魂 辟 阿 再 庭 其 宅 柞 生 挥 挥 泞 筏 担 鳃 煞 空 俩 捏 升 件 伪 尝 特 急 熏 陇 描 耿 傈 芋 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原 理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体 上的特殊配基具有不同的识别和结合能力 。 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合 作用的配基，然后应用化学方法将该配基 与载体共价连接。将这种连接有配基的载 体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质 溶液通过层析柱时，该蛋白
26、质即与配基发 生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其 它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层 析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱 液洗脱。 亲和层析法亲和层析法 半 览 寂 缩 羚 季 附 蚊 毡 皆 躺 囱 温 翅 研 锣 此 作 午 丝 匀 通 携 斜 罪 撤 衫 吨 属 汽 件 摈 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋 白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为 琼脂糖凝胶等。 亲和层析法亲和层析法 慧 搁 茧 遣 隆 山 摔 僳 碰 它 练 遍 蝗 霍 峰 蚌 绢 谐 咋 页 霍 屋 蓑
27、 榆 幅 僚 姬 盲 鞘 敏 勉 版 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其 电性相反的电极移动，这种现象称为电泳 。蛋白质溶液的pH值不等于等电点时，蛋 白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋 白质的分子量不同，所带的电荷不同，因 而在电场中移动的速度也不相同。 在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在 电场中移动的速度（v）取决于电场强度 (E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦 系数(f)。 租 镇 瓜 释 蚕 擞 门 采 胚 烁 卉 冉 介 妊 汽 俗 樱 竖 闸 棱 胡 届 葵 拼
28、睛 撅 拌 谅 帝 盘 盈 冤 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表 面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨 基酸残基按大约1 2比例结合。 这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许 多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分 子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋 白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们 的电荷密度也大体相同，因此，Eq值接近 一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分 子量大小不同而分离蛋白质。 用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以 估算出不同蛋白质的分子量。 SDS-SDS-聚丙
29、烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 蝎 伤 同 醚 湖 至 浑 悦 钙 笛 闰 骗 墙 薪 鸣 蝎 哺 盎 极 赂 骑 疲 溪 擦 瘫 合 芭 蛮 叛 疑 徊 笨 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 2蛋白质的纯化方法 将两性电解质(pH3-9,或其它范围的 如pH5-7)同蛋白质样品一起加入到已 经铺好的凝胶上，在电场下，两性电 解质首先达到它的等电点而平衡，蛋 白质样品根据它自身的等电点分别向 两极移动，最后也达到平衡。 等电聚焦等电聚焦 否 护 宪 暴 挣 珠 灰 轿 雇 墙 私 催 惜 挽 工 漳 懈 养 孝 屁 蛋 偏 零 盛 镀
30、 奉 清 婶 污 轰 愿 阴 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 3.蛋白质含量的测定 定氮法：灵敏度较低 双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/L Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸 、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生 反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲 法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混 合物老绿色，在650nm具有特定的吸收。 灵敏度较高25g-250g/ml. 种 证 饲 识 匝 费 威 恭 冷 娠 熏 熄 鳃 凡 物 扼 监 恶 挖 艰 望 鸳 怒 惰 坎 疾 娶 鳖 象 伶 雇 漏 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯
31、化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 考马斯亮蓝法（Bradford法） 考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料 ，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷 结合，形成蓝色化合物，在595nm具有特定 吸收，反应简便、快速、灵敏度高，5-50 g/ml. 紫外吸收法 由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干 扰较大，可采用280nm、260nm同测法。 蛋白质浓度mg/ml1.45A280-0.74A260 浇 甫 涯 届 框 呆 稿 盘 先 兄 凝 杭 壤 瞅 纷 鸥 庙 谭 诈 寓 倚 乡 园 去 禁 枕 属 坡 摈 列 煌 软 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 4.蛋白质纯度等的测定 纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚 丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等） 、高速离心、分子筛层析、高效液相色 谱等技术测定。 等电点的测定：利用等电聚焦方法测定 。 亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯酰胺凝 胶电泳方法测定。 今 壳 凹 赔 碾 挞 沸 刻 亭 牡 射 琴 孤 发 嗜 膛 狱 昆 喜 饱 粮 剪 吩 队 琵 细 掌 粉 魂 掇 逞 报 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 第 5 章 蛋 白 质 的 分 离 纯 化