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1、设备培训-高效液相色谱2013.05.14安捷伦1260高效液相色谱培训课件概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。安捷伦1260高效液相色谱培训课件色谱原理l色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）

2、的大小、强弱不同在固定相中滞留时间不同从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法安捷伦1260高效液相色谱培训课件高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构：一般可分为5个主要部分：高压输液系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统、数据处理系统。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。安捷伦1260高效液相色谱培训课件 一、高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，

3、为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液装置、脱气装置、高压输液泵、过滤器等组成，其中高压输液泵是核心部件。输液泵分为恒流泵和恒压泵两种，但是目前恒流泵已经基本取代了恒压泵。1、输液泵应具备性能:A、流量稳定，其变异系数应小于0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；B、流量范围宽，分析型应该在01-10mL/min范围内连续可调，制备型应能达到100mL/min；C、输出压力高，一般应能达到150-300kgf/cm2（kgf/cm2=98.0665kpa）；D、液缸溶剂小；E、密封性好，耐腐蚀。安捷伦1260高效液相色谱培训课件2 2、输输液液泵

4、泵的使用和的使用和维护维护注意事注意事项项A A、防止任何固体微粒、防止任何固体微粒进进入入泵泵体，因体，因为尘为尘埃或其他任何埃或其他任何杂质杂质微粒都能磨微粒都能磨损损柱塞、密封柱塞、密封环环、缸体和、缸体和单单向向阀阀，因此，因此应预应预先先除去流除去流动动相中的任何固体微粒；相中的任何固体微粒；B B、流、流动动相不相不应应含有任何腐性物含有任何腐性物质质含有含有缓缓冲液的流冲液的流动动相不相不应应保留在柱内，尤其是在停保留在柱内，尤其是在停泵过泵过夜或更夜或更长时间长时间的情况下。如的情况下。如果含有果含有缓缓冲溶液的流冲溶液的流动动相在柱内，由于蒸相在柱内，由于蒸发发或泄漏，甚至或

5、泄漏，甚至由于溶液的静置，就可能析出由于溶液的静置，就可能析出盐盐的微的微细细晶体。晶体。这这些晶粒将些晶粒将损损坏密封坏密封环环和柱塞等。因此，和柱塞等。因此，仪仪器在关机前必器在关机前必须须将将泵泵清洗清洗干干净净，再，再换换成适合色成适合色谱谱柱保存的和有利于柱保存的和有利于泵维护泵维护的溶的溶剂剂。C C、泵泵工作工作时时要留心防止溶要留心防止溶剂剂瓶内的流瓶内的流动动相被用完，否相被用完，否则则空空泵泵运运转转也会磨也会磨损损柱塞、缸体或密封柱塞、缸体或密封环环，最，最终产终产生漏液。生漏液。D D、输输液液泵泵的最高的最高压压力不要超力不要超过规过规定的最高定的最高压压力力值值，否

6、否则则会会使高使高压压密封密封环变环变形。形。E E、流、流动动相相应该应该先脱气，以免在先脱气，以免在泵泵内内产产生气泡，影响流量的生气泡，影响流量的稳稳定。定。安捷伦1260高效液相色谱培训课件二、进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。1、进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱柱系统的压力、流量影响小。2、进样

7、方式：隔膜泵进样、停留进样、阀进样、自动进样。安捷伦1260高效液相色谱培训课件三、色谱分离系统 色谱分离系统包括：色谱柱、固定相和流动相。其中，色谱柱是其核心部分。1、色谱柱的构造色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。2、色谱柱的类型 色谱柱按照用途分为分析型和制备型两类。a、常规分析柱（常量柱）一般色谱柱长1030cm，内径为25mm（常量4.6mm，国内有4mm和5mm），凝胶色谱柱内径312mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。b、窄径柱（细管径柱、半微量柱

8、柱长1030cm，内径12mm 安捷伦1260高效液相色谱培训课件 c、毛细管柱（微柱）内径0.20.5mm d、半制备柱，内径5mm。e、实验室制备柱，柱长10 30cm，内径20 40mm f、生产制备柱，内径可达几十厘米。注：一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。安捷伦1260高效液相色谱培训课件3 3、色、色谱谱柱的使用和注意事柱的使用和注意事项项A、避免温度和压力的急剧变化及任何机械振动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下会影响柱内的填充情况；柱

9、压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流量时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。B、应逐渐改变溶剂组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改为全部是水，反之亦然。C、一般情况下色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去柱内杂质，否则反冲会迅速降低柱效。D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。安捷伦1260高效液相色谱培训课件E E、避免将基、避免将基质质复复杂杂的的样样品尤其是生物品尤其是生物样样品直接品直

10、接进进入柱内，入柱内，需要需要对样对样品品进进行行预处预处理或者在理或者在进样进样器和色器和色谱谱柱之柱之间连间连接一接一个保个保护护柱，保柱，保护护柱一般是填有固定相的短柱，保柱一般是填有固定相的短柱，保护护柱可以柱可以经经常更常更换换。F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接头拧紧，防止溶剂会发干。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内，静置过夜或更长时间。H、色谱柱使用过程中，如果压力升高，可能的原因有：色谱柱进口过滤芯被污染、冲洗阀过滤芯被污染、色谱柱被污染、连接管路的毛细管堵塞、进样器转子上的凹槽被污染、进样针或针座被堵塞。若发现压力升高，

11、进行分段检查，排除故障。安捷伦1260高效液相色谱培训课件四检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:安捷伦1260高效液相色谱培训课件（l）可）可变波波长测器器（2）荧光光检测器器(3)示差折光率示差折光率检测器器几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gcm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯

12、度淋洗。（4）二极管）二极管阵列列检测器器 性能/优点：灵敏度高、有四种类型的DAD模块选择、具有1024个二极管和可变狭缝、可根据需要选择不同的流动池、可进行自动峰检索、利用紫外谱图可进行色谱峰定性。(5)蒸蒸发光散射光散射检测器器安捷伦1260高效液相色谱培训课件日常维护常见色谱故障-基线噪音可能原因:a、检测池脏b、检测池灯能量下降c、由泵引起的脉冲d、检测器上的温度效应e、检测其中有气泡通过常见色谱故障-基线漂移可能原因:a、梯度洗脱所用溶剂有吸收b、流动相脏c、色谱柱没有用流动相平衡d、系统中污染物溢出e、实验温度不稳定安捷伦1260高效液相色谱培训课件 常见色谱故障-鬼峰常见原因是

13、流动相脏，尤其是水相。要求使用超纯水，最多两天就常见色谱故障-双峰可能原因：a、柱头塌陷或柱床运动b、柱前滤芯堵塞c、组分共流出d、样品量过大f、进样器的进样流路存在分叉流路常见色谱故障-峰扩展可能原因：a、柱效降低或有柱塌陷b、进样体积过大c、流动相粘度大安捷伦1260高效液相色谱培训课件常见色谱故障-拖尾峰可能原因：可能原因：a a、柱效降低或有柱塌陷、柱效降低或有柱塌陷 b b、进样进样体体积过积过大大 c c、柱外、柱外扩扩散效散效应应 d d、碱性基、碱性基质质与硅与硅羟羟基作用基作用 e e、重金属反、重金属反应应常见色谱故障-前伸峰可能原因：可能原因：a a、色、色谱谱柱柱过载过

14、载 b b、进样进样体体积过积过大大 c c、大峰之前有未、大峰之前有未彻彻底分离的小峰底分离的小峰常见色谱故障-负峰可能原因：可能原因：a a、样样品吸收比流品吸收比流动动相吸收小相吸收小 b b、溶解、溶解样样品的溶品的溶剂剂通通过过色色谱谱柱平衡被破坏柱平衡被破坏 c c、示差、示差检测检测器中最常器中最常见见，溶，溶质质的折光指数小于的折光指数小于 溶溶剂剂的折光指数。的折光指数。安捷伦1260高效液相色谱培训课件 常见色谱故障-压力过高可能原因：a、色谱柱进样口过滤芯被污染b、冲洗阀过滤芯被污染c、色谱柱被污染d、连接管路的毛细管堵塞e、进样器转子上凹槽被堵塞f、进样针或针座被阻塞常见色谱故障-压力过低可能原因：a、溶剂进样口过滤芯堵塞b、连接管路泄漏c、溶剂或流速改变d、主动阀失灵、四元比例阀失灵或单向阀失灵e、色谱柱失效（固定相流失）安捷伦1260高效液相色谱培训课件