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1、微生物学检验 国家卫生和计划生育委员会规划教材 第十九章 临床常见标本的细菌学检验 返回总目录 本 章 内 容 第一节 概述 1 第二节 临床常见标本的细菌学检验 2 学习目标： 掌握临床常见标本的采集、送检和处理的原则 临床常见标本细菌学检验程序、检验方法及结果报告 熟悉TAT、危急值在临床实际工作中的应用 临床标本常见病原菌的检验方法及鉴定要点 了解临床标本细菌学检验的临床意义 临床标本中正常菌群的分布及常见致病菌 本章重点： 病毒标本采集和运送原则 病毒学诊断及鉴定常用方法 病毒培养的基本操作 学习目标及重点 第一节 概述 一、临床标本的采集、送检与处理原则 （一）临床标本的采集 1.核
2、对检验单信息 信息完整、无误 2.选择适当的容器 3.早期采集 使用抗菌药物前 4.无菌采集 严格无菌操作技术 第一节 概述 5.选择采集部位和方法 第一节 概述 6.充足的标本量 足量、适量 7.标记标本 8.归放标本 符合生物安全防护要求 第一节 概述 （二）临床标本的保存和送检 立即送检，否则应放入运送培养基或保存液中运送 1.普通细菌培养标本 室温：1小时，4：24小时，运送培养基：48小时 2.苛养菌培养标本 保温、保湿送检，“床头接种” 第一节 概述 3.厌氧菌培养标本 防干燥，避免接触空气。 4.安全运送 注意安全防护 高致病性传染病标本，按生物安全有关规定包装， 由专人运送 第
3、一节 概述 （三）临床标本的处理 核对标本与申请单信息 常见标本处理方式 组织：无菌粉碎研磨后，加生理盐水制成悬液，接种 体液：3000r/mim离心10分钟后，接种。 棉拭子：置运送培养基送检，避免污染。 粪便：挑取带脓、血及黏液部分接种。 痰液：检查标本是否有血液、脓液、颗粒、干酪样物等 血液：采集后立即增菌培养 厌氧菌培养：检查标本、运送方式是否适合厌氧培养，立 即接种 第一节 概述 二、培养基及培养方法的选择 1.培养基 选择恰当的培养基或组合 第一节 概述 电热恒温培养箱 二氧化碳培养箱厌氧培养箱 2.常用培养方法 需氧培养、二氧化碳培养和厌氧培养 第一节 概述 三、细菌学检验的基本
4、流程 （一）细菌学检验的基本程序 第一节 概述 （二）细菌学检验鉴定步骤 1.标本性状观察 颜色、是否粘稠、是否浑浊、是否脓性、是否带血等 性状 第一节 概述 革兰染色抗酸染色墨汁染色 2.涂片检查 不染色标本检查 ：检查细菌的动力 染色标本检查 第一节 概述 3.细菌的分离培养 目的：得到单个纯菌落 甄别污染菌方法 观察菌落是否在划线上 观察菌落是否与直接涂片染色结果相符 观察菌落是否符合拟培养细菌的生长特点 注意培养时间 第一节 概述 4.细菌的鉴定 选择细菌检验鉴定方法的原则 选择有鉴定价值的试验：两种细菌出现不同的结果 选择快速、简易的试验：如触酶、氧化酶 综合考虑试验的敏感性和特异性
5、 第一节 概述 5.细菌对抗菌药物敏感性试验 纸片扩散法 肉汤稀释法 自动化仪器法 E-test法等。 第一节 概述 返回本章内容 四、细菌学检验报告原则 标本周转时间（TAT）：从标本采集起到临床医生收到检验结 果的时间 危急值：指危及到患者生命健康安全的检验结果 检验报告原则 初报告 预报告 最终报告 报告抗菌药物敏感性试验结果 第一节 概述 一、血液及骨髓标本的细菌学 检验 （一）标本的采集 1.皮肤消毒 严格执行三步法 2.采血部位： 肘静脉 肘动脉或股动脉采血 婴幼儿采颈静脉血 第二节 临床常见标本的细菌学检验 3.采集方法 严格无菌操作 4.采血量 比例：1:10 成人810ml/
6、瓶 儿童15ml/瓶 婴儿12ml/瓶 骨髓12ml/瓶 第二节 临床常见标本的细菌学检验 疾病24小时内24小时后 菌血症、败血症23份 细菌性心内膜炎3份（12小时）2份 不明原因发热23份2份 5.采血时间和頻度 6.标本的运送和保存 立即送检，室温保存，切勿冷藏 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （二）微生物学检验 1.常见病原菌 第二节 临床常见标本的细菌学检验 2. 检验程序 第二节 临床常见标本的细菌学检验 培养基性状改变疑似病原菌 均匀混浊，指示剂变色革兰阴性杆菌 微混浊，有绿色变化肺炎链球菌 有菌膜，均匀混浊有绿色荧光铜绿假单胞菌 上层澄清，下层有沉淀链球菌 细胞层自上而下的
7、溶血溶血性链球菌 混浊、有胶冻状凝固现象葡萄球菌 灰白色菌膜、培养基清晰枯草芽孢杆菌或类白喉棒状杆菌 3.检验方法 （1）普通细菌的培养与鉴定 增菌培养：培养阳性指证及疑似菌列表 第二节 临床常见标本的细菌学检验 阳性培养瓶 直接药敏试验 分离培养 涂片染色镜检 细菌鉴定 药敏试验 报告 报告 报告 阳性培养瓶处理 阴性培养瓶处理 于1218小时、第3天和第7天至少做 3次盲传，7天无细菌生长报告阴性 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （2）特殊细菌培养与鉴定 脑膜炎奈瑟菌 血液 骨髓 胰胨肉汤或 专业培养瓶 巧克力培养基 （35, 510C02） 鉴定：葡萄糖、麦芽 糖发酵阳性 药敏：CLS
8、I标准 脑膜炎奈瑟菌菌落 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （2）特殊细菌培养与鉴定 草绿色链球菌 血液 骨髓 血琼脂平板 （35, 510C02、 需氧和厌氧环境） 胰酶解酪蛋白 大豆肉汤培养瓶 鉴定 药敏试验 草绿色链球菌草绿色链球菌菌落 7天培养无细菌生长，培养至第4周，仍无细菌生长则报告“经4周 培养无草绿色链球菌生长” 第二节 临床常见标本的细菌学检验 血液 骨髓 葡萄糖胆汁 或胆盐肉汤 MAC、SS 35培养 鉴定;KIA、生化反应、 血清学试验等 药敏试验 血液 骨髓 肝浸液肉汤 肝浸液平板或血平板 （35, 510C02 ） 涂片、生化鉴定 血清学试验 伤寒沙门菌及其他沙门菌
9、布鲁菌 培养4周无细菌生长，报告“经4周培养无细菌生长” 第二节 临床常见标本的细菌学检验 标本 牛心脑浸液 或肝浸液 血平板或巧克力平 板 35、厌氧培养 生化鉴定 厌氧菌 真菌： 真菌增菌肉汤增菌沙保弱培养基（25或37）菌落 特征生化鉴定、报告 L型细菌 高渗液体培养基血琼脂平板和L型细菌培养基典型“ 油煎蛋”菌落返祖、鉴定 第二节 临床常见标本的细菌学检验 4.结果报告 采取分级和限时报告制度 初报告：将镜检结果电话通知主管医生 预报告：68小时内报告直接药物敏感结果 最终报告：报告细菌种属、药敏试验、结果评价及建议 阴性报告 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （三）临床意义 排除杂菌
10、污染，从血液和骨髓标本中检出任何细菌都具 有临床意义 葡萄球菌是血液感染最常见的细菌 草绿色链球菌是亚急性心内膜炎的主要致病菌 尿路、胆道、胃肠道炎症粘膜损伤引起的败血症以大肠 埃希菌多见 产单核李斯特菌主要引起新生儿败血症 第二节 临床常见标本的细菌学检验 互动讨论 草绿色链球菌属人体正 常菌群，试分析从血液和痰 液标本中分离出草绿色链球 菌各有何临床意义？ 第二节 临床常见标本的细菌学检验 二、脑脊液标本的细菌学检验 （一）标本的采集 1.采集部位 腰椎穿刺法 2.采集量 35ml 3.标本的运送和保存 15分钟内送检，最迟不能超过1小时。疑似苛养菌感染时， 应保温送检 第二节 临床常见标
11、本的细菌学检验 （二）微生物学检验 1.常见病原菌 第二节 临床常见标本的细菌学检验 2.检验程序 第二节 临床常见标本的细菌学检验 肺炎链球菌 脑膜炎奈瑟菌流感嗜血杆菌 3.检验方法 （1）涂片检查 革兰染色 第二节 临床常见标本的细菌学检验 抗酸染色 墨汁负染色 新型隐球菌 结核杆菌 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （2）分离培养与鉴定 普通细菌 标本血琼脂平板和巧克力平板（35，CO2环境） 可疑菌落形态、生化试验及血清学试验、药敏试验 结核分枝杆菌 标本罗-琴培养基或米氏7H-10培养基35温箱孵育 可疑菌落鉴定 第二节 临床常见标本的细菌学检验 真菌 标本血平板或沙保弱培养基25及
12、37孵育 可疑菌落形态、镜检及生化反应等鉴定。 厌氧菌 标本血平板、厌氧血琼脂平板和硫乙醇酸钠肉汤 35需氧、厌氧培养可疑菌落染色镜检及生化鉴 定、药敏试验 第二节 临床常见标本的细菌学检验 4.结果报告 初报告：报告标本直接涂片结果 预报告：报告标本直接药敏试验结果 最终报告：报告细菌种属、药敏试验、结果评价及建议 阴性报告 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （三）临床意义 脑膜炎奈瑟菌引起细菌性脑膜炎 结核分枝杆菌引起的结核性脑膜炎 真菌性脑膜炎最常见的病原体是新型隐球菌，白假丝酵 母菌、球孢子菌好发于免疫功能低下和恶性疾病患者 第二节 临床常见标本的细菌学检验 三、尿液（泌尿生殖道）标本
13、的细菌学检验 （一）标本的采集 1.中段尿采集法 2.导尿法 3.膀胱穿刺采集法 4.集尿法 5.标本的运送和保存 立即送检、及时接种 室温不超过2小时，4不超过8小时 淋病奈瑟菌感染尿液标本不能冷藏 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （二）微生物学检验 1.常见病原菌 第二节 临床常见标本的细菌学检验 2.检验程序 第二节 临床常见标本的细菌学检验 3.检验方法 （1）涂片检查 普通细菌检查：取沉淀涂片、染色、镜检 淋病奈瑟菌检查 第二节 临床常见标本的细菌学检验 念珠菌检查 结核分枝杆菌检查：应与耻垢分枝杆菌相鉴别 钩端螺旋体检查：暗视野显微镜下，发现一串细密亮珠、两 端呈钩状且沿纵轴旋转
14、运动的螺旋体时，报告找到螺旋体 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （2）尿液细菌计数 计算：cfu/ml=菌落数稀释倍数 或cfu/ml= 意义 革兰阳性球菌大于104cfu/ml,革兰阴性杆菌大于 105cfu/ml，应考虑为泌尿系统感染 第二节 临床常见标本的细菌学检验 淋球菌菌落 （3）分离培养与鉴定 普通细菌培养：沉淀物血平板和麦康凯平板 35培养菌落观察染色镜检、生化反应、抗菌药物 敏感试验 淋病奈瑟菌培养：标本TM或MTM平板 35、 5 10CO2环境疑似菌落涂片镜检、生化反应鉴定 第二节 临床常见标本的细菌学检验 4.结果报告 初级报告：标本涂片染色镜检结果，如“找到革兰阴 性
15、双球菌，存在于细胞内（外），形似淋病奈瑟菌” 最终报告：报告细菌种属、菌落计数、药物敏感性试 验、结果评价及建议 阴性报告：48小时无细菌生长者，报告“48小时培养 无细菌生长” 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （三）临床意义 尿液中细菌数少于104cfuml或104105cfu/ml之间，反 复多次查出同一细菌时，一般也认为是病原菌。 同份尿液中检出三种或以上不同微生物，应认为标本采 集或处理不当被污染。 尿液细菌学检查结果，应结合临床考虑综合 第二节 临床常见标本的细菌学检验 直肠肛拭子 四、粪便标本的细菌学检验 （一）标本的采集 1.自然排便法 脓血、黏液粪便23克 2.直肠拭子法 成
16、人45厘米 幼儿23厘米 3.标本的运送和保存 卡-布（Cary-Blair）运送培养基 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （二）微生物学检验 1.常见病原菌 第二节 临床常见标本的细菌学检验 2.检验程序 第二节 临床常见标本的细菌学检验 3.检验方法 （1）涂片检查 霍乱弧菌检查： 动力检查：动力及制动试验 染色镜检：革兰染色，发现鱼群状排列的革兰阴性弧菌 ，可做出初步报告 酵母样菌检查 第二节 临床常见标本的细菌学检验 葡萄球菌 艰难梭菌弯曲菌 （1）涂片检查 葡萄球菌、艰难梭菌、弯曲菌检查 粪便中优势菌检查：推定主要优势菌并及时报告结果 第二节 临床常见标本的细菌学检验 沙门菌志贺菌
17、（2）分离培养与鉴定 沙门菌及志贺菌培养 粪便或直肠拭子SS平板、麦康凯平板、GN增菌液35 、需氧培养可疑菌落生化试验、血清学反应鉴定 第二节 临床常见标本的细菌学检验 五种致病性大肠埃希菌 ETEC-肠产毒大肠埃希菌 EPEC-肠致病大肠埃希菌 EIEC-肠侵袭大肠埃希菌 EHEC-肠出血大肠埃希菌 EaggEC肠凝聚性大肠埃希菌 （2）分离培养与鉴定 致病性大肠埃希菌培养 脓血或糊状粪便麦康凯/伊红美蓝/中国蓝平板35、 需氧培养可疑菌落生化反应、多价血清凝集试验鉴定 第二节 临床常见标本的细菌学检验 霍乱弧菌培养 米泔水样粪便碱性蛋白胨水增菌碱性 琼脂平板或TCBS平板35需氧培养 可
18、疑菌落形态检查、动力及制动试验、 血清学试验鉴定 副溶血性弧菌培养 粪便、可疑食物、呕吐物3.5%NaCl蛋白 胨水增菌SS平板、TCBS平板35需氧 培养可疑菌落生化试验及耐盐试验鉴 定 第二节 临床常见标本的细菌学检验 金黄色葡萄球菌培养 粪便、肛拭子、可疑食物甘露醇高 盐琼脂平板、血琼脂平板35需氧培 养可疑菌落革兰染色、凝固酶、DNA 酶及甘露醇发酵鉴定 小肠结肠耶尔森菌培养 标本 NYE、1/15M磷酸盐増菌液 4 、2530、35、需氧环境 可疑菌落生化反应、血清学试验鉴定 第二节 临床常见标本的细菌学检验 小肠结肠炎耶尔森菌 空肠弯曲菌培养 标本Camp-BAP、Skirrow或
19、Butzler血琼脂43、微需氧环 境有色半透明菌落动力、生化试验鉴定。 艰难梭菌培养 标本CCFA平板35、厌氧环境可疑菌落生化鉴定、毒 素试验 第二节 临床常见标本的细菌学检验 真菌培养 标本沙保弱琼脂平板、血琼脂平板25及37培养 可疑菌落镜检、芽管及厚膜孢子试验等鉴定 4.结果报告 初级报告：镜检典型阳性结果，报告临床。 最终报告：报告细菌种属、药敏试验、结果评价及建议 ；检出霍乱弧菌应立即向当地疾病预防控制中心报告 阴性报告：根据分离目的菌而定 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （三）临床意义 能引起肠道感染的常见致病菌有沙门菌、志贺菌、霍乱 弧菌及致病性大肠埃希菌等。 能引起食物中
20、毒的常见致病菌有沙门菌、副溶血弧菌、 致病性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽 胞杆菌等 幽门螺杆菌是引起胃炎、消化性溃疡主要致病菌，胃癌 的危险因子 第二节 临床常见标本的细菌学检验 互动讨论 正常人粪便中含有大量细 菌，而能引起肠道感染的细菌 种类较多，致病菌和正常菌往 往共存生长。试分析如何快速 准确的检出致病菌？ 第二节 临床常见标本的细菌学检验 五、痰液（呼吸道）标本的细菌学检验 （一）标本的采集 1.自然咳痰法 晨痰最佳，深部痰 2.小儿取痰法 3.特殊器械采集法 4.标本的运送和保存 立即送检，室温不超过2小时 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （二）微生物学检验 1.
21、常见病原菌 第二节 临床常见标本的细菌学检验 2.检验程序 第二节 临床常见标本的细菌学检验 白细胞数(LP)上皮细胞数(LP)细菌培养 25个10个合格 10个25个不合格 3.检验方法 （1）涂片检查 目的: 确定标本是否适合做细菌培养 为选用培养基提供参考 适合细菌培养的痰液镜检标准 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （1）涂片检查 普通细菌检查：涂片行革兰染色镜检，根据染色性、形 态及排列初步报告 结核杆菌检查：制成厚涂片，抗酸染色镜检 放线菌及诺卡菌检查 硫磺样颗粒涂片 衣氏放线菌 第二节 临床常见标本的细菌学检验 痰培养前的处理 痰液的洗净 痰液的均质化 普通细菌培养 嗜肺军团菌培
22、养 标本血琼脂、巧克力琼脂和BCYE琼脂平板35，5 10CO2环境根据培养时间、菌落特点等鉴定 （2）细菌的培养与鉴定 第二节 临床常见标本的细菌学检验 异染颗粒 白喉棒状杆菌培养 标本吕氏血清斜面、血琼脂平板和亚碲酸钾琼脂平板 35、需氧环境典型菌落形态、生化试验、毒力试 验 第二节 临床常见标本的细菌学检验 百日咳鲍特菌在CCBA培养基菌落 鲍特菌培养 标本鲍-金培养基35、需氧环境可疑菌落涂片镜检、 生化及血清学试验等鉴定 4.结果报告 初级报告：典型阳性结果，立即向临床报告 最终报告：报告细菌种属、药敏试验、各细菌所占比例、结果 评价及建议 阴性报告：报告“正常菌群”或“生长细菌的种
23、类、数量” 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （三）临床意义 上呼吸道感染是最常的呼吸道感染症 下呼吸道感染最常见的疾病是细菌性肺炎，肺炎链球菌是主要病 原菌 医院获得性肺炎的病原体50%以上是革兰阴性杆菌 真菌性肺炎的常见菌以白假丝酵母菌为主，曲霉、毛霉和隐球菌 也可见 第二节 临床常见标本的细菌学检验 六、脓液（病灶分泌物）标本的细菌学检验 （一）标本的采集 开放性脓肿 瘘管 1.拭子采集法 开放性性脓肿 2.沙布条采集法 瘘管的放线菌感染 3.注射器抽吸法 封闭性脓肿 4.标本运送与保存 厌氧标本“床边接种” 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （二）微生物学检验 1.常见病原菌 第二节
24、临床常见标本的细菌学检验 2.检验程序 第二节 临床常见标本的细菌学检验 3.检验方法 （1）涂片检查 普通细菌检查：根据形态和染色特点，报告 放线菌检查：查找“硫磺样颗粒”，挑取 “硫磺样颗粒” 制片。 用低倍镜及高倍镜检查并报告 厌氧芽孢梭菌检查：描述是否有芽胞、芽胞位置及形状 破伤风芽孢梭菌厌氧芽孢梭菌 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （2）分离培养与鉴定 普通细菌培养 标本血平板、中国蓝/麦康凯平板35、需 氧培养典型菌落染色镜检、生化反应等鉴定 产气荚膜梭菌培养 标本血琼脂平板、卵黄琼脂平板、庖肉培 养基35、厌氧环境可疑菌落染色镜检、生物学性状鉴 定 双层溶血环 Nagler反应
25、 汹涌发酵 第二节 临床常见标本的细菌学检验 4.结果报告 初级报告：报告“找到革兰性球（杆）菌，呈排列，形似 细菌” 最终报告：报告“检出细菌”、药敏试验、结果评价及建议 阴性报告：报告“经48小时培养无细菌生长” 特殊菌感染，应延长培养时间 第二节 临床常见标本的细菌学检验 （三）临床意义 葡萄球菌和链球菌是引起外伤性创伤感染最常见的细菌 深部创伤和复杂性骨折，可发生厌氧菌感染 烧伤创面感染最常见细菌是铜绿假单胞菌 放线菌感染可发生在拨牙、口腔黏膜损伤时 第二节 临床常见标本的细菌学检验 烧伤后感染 案例分析 返回章内容 1.患者男性，22岁。10天前无诱因发热，体温逐渐上升，近3 天体温持续38.539.5不降，伴食欲下降、乏力、腹胀。 血常规：WBC3.5109/L，分类中性分叶核细胞60%，淋巴细 胞40%。该患者患何种疾病？如何采集临床标本？如何进行微 生物学检验？