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1、摘 要石蜡切片是组织学、发育生物学研究的主要实验方法，同时也是病理学中观察病理变化的重要手段，为科研和临床做出了卓越贡献。该技术应用石蜡与动植物的组织能够很好地结合这一基本原理，经过标本采集、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、摊片、贴片、烘片、脱蜡、染色、脱水、透明等一系列特殊处理方法制成透明的薄片，在显微镜下观察肉眼看不到的结构，为更深入的研究做准备。关键词：鸡 腿肌 组织切片目 录1 前言12 材料与方法22.1 材料22.1.1 主要试剂22.1.2 主要仪器设备22.2 方法32.2.1 32.2.2 32.2.3 32.3 42.3.1 42.3.2 52.4 52.4.1 52.
2、4.2 62.4.3 72.4.4 82.4.5 83 结果与分析83.1 83.2 93.3 93.4 104 讨论11参考文献致谢 1 前言 大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚，光线不易透过，另外由于细胞内各个结构的折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辩明。 组织学切片是教学和科研中常用的方法。组织在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后，用切片机切成较薄的切片，再经不同的染色就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，组织切片也便于保存。组织学切片的制作技术是组织学，胚胎学，生物学、病理学、肿瘤学、法医学及临床诊断学等学科研究
3、观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要手段。组织学切片法是必须依靠切片机将组织切成薄片来进行观察的方法。为了能清晰地观察到组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，主要分为石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要脱蜡，染色，脱水，透明等步骤，将其制成永久标本。石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。现以鸡腿肌组织的石蜡切片制作为例，介绍切片标本的制备方法。2 材料与方法2.1 材料鸡？只，购于？。2.1.1 器材和仪器：切片机、纱布、绸布、剪刀、镊子、刀片
4、、毛笔、载玻片、盖玻片、烤箱、显微镜、烧杯、酒精灯、蜡杯、蜡刀、染色架、冲洗盒、包埋筐、片盘等。石蜡切片机HistoSTAT-820型，美国Reichert公司生物组织摊片烤片机湖北省医用电子仪器厂光学显微镜日本Olympus公司生物组织自动脱水机YG-12T型，阳光神琦医用科技有限公司生物组织包埋机及冰冻台BM-V型，湖北省医用电子仪器厂2.1.2 试剂：苏木精、伊红、二甲苯、中性树胶、乙醇、石蜡、氨水、盐酸、甘油蛋白等。EDTASigma公司H2O2国药集团化学试剂有限公司冰乙酸、盐酸国药集团化学试剂有限公司铝化钾、NaCl国药集团化学试剂有限公司甲醛、氯仿、二甲苯、石蜡国药集团化学试剂有
5、限公司苏木精、伊红国药集团化学试剂有限公司中性树胶国药集团化学试剂有限公司无水乙醇、异丙醇、正丁醇、甘油广州市东红化工厂固定液Bouin氏液配方：苦味酸饱和水溶液 75份 ，福尔马林 25份，冰醋酸 5份蛋白甘油：将鸡蛋清充分搅拌，用纱布过滤后，加入等量甘油搅拌混合，至均匀为止。加入约为1%量的麝香酚小块，借以防止微生物的侵入和腐败。放入冰箱备用。染色液：细胞质染色液：1伊红（95乙醇稀释）细胞核染色液：苏木精2g 硫酸铝铵3g 甘100ml 无水乙醇100ml 蒸馏水100ml 动物组织：2.2 方法2.2.1 取材2.2.1.1 采取颈静脉放血的方法进行活禽宰杀，然后迅速将其尸体表面及羽毛
6、完全浸润，移入搪瓷盘中进行剖检。2.2.1.2 将禽的尸体背位仰卧，在腿腹之间剪开皮肤，然后紧握大腿股骨，用手将两条腿掰开，直至股骨头和髋臼分离，这样两腿将整个家禽的尸体支撑在搪瓷盆上。2.2.1.3 剥离腿部皮肤暴露腿部肌肉，取大小如下的腿肌组织块：长1cm宽1cm厚0.20.3cm。 图一 取材（draw materials） 2.2.2 固定新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后，应立即采用一种方法，将组织尽可能保持原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固定。化学固定法就是用化学试剂配制成固定液使组织固定。 具体
7、方法如下：将取好的腿肌组织尽快的浸入相当于组织体积2030倍的10%福尔马林固定液中固定24h（图二）。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止，使之与存活的原有形态和结构相似而不发生变形，从而达到使组织变硬以便于切片、增强内含物的折光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。组织固定后保存于加盖的容器内，贴上标签。标签上注明固定液、材料来源、日期等 图二 固定（fixation） 2.2.3 洗涤将上述腿肌放入专用小框，流水冲洗12h（图三）。图三 冲洗（flushing）2.2.4 脱水（Dehydration）由于石蜡不溶于水，而本实验中采用的固定以后的腿肌组织中仍含有水分，需先进行
8、脱水。脱水是用一种既能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。现最常采用的脱水剂是乙醇，进行梯度脱水，此外， 丙酮、正丁醇、松脂醇等也可作为脱水剂（图四）。脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。由于动物含水量较大，直接用无水乙醇脱水会导致组织收缩变性，因此采用梯度浓度法脱水，具体操作见表1（图五）。50%酒精、50%蒸馏水6h50%酒精、20%正丁醇、30%蒸馏水5h50%酒精、35%正丁醇、15%蒸馏水4h45%酒精、45%正丁醇、10%蒸馏水、3h40%酒精、55%正丁醇、5%蒸馏水3h25%酒精、75%正丁醇2h15%酒精、85%正丁醇1.5h5%酒精、95%正丁醇1h10
9、0%正丁醇1h100%正丁醇1h100%正丁醇1h 图四 脱水试剂（dehydrate reagent） 图五 各浓度梯度乙醇(concentration gradient ethanol)其中，在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体；在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片；脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。 2.2.5 透明 脱水后，组织内含有大量的乙醇。由于石蜡不溶于水，也不溶于醇类试剂。因此，必须用一种既能与乙醇又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的包埋创造一个有利的条件，该过程
10、即透明。现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。本实验采用二甲苯，二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。操作如下：将上述脱水过的腿肌组织在二甲苯中浸泡30min，当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态（图六）。 图六 透明(Transparent)其中，使用二甲苯时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入，在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。 2.2.6 浸蜡将完成透明步骤的组织块浸
11、入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用液态石蜡完全置换出组织块中的透明剂，最后，组织细胞内被大量石蜡支撑，室温时石蜡凝固成固态，使组织能用于石蜡切片。一般在恒温箱中进行。将恒温箱的温度设置成高于石蜡熔点23，浸蜡时间34个小时，具体如下：软蜡（4850）15min软蜡（5456）20min硬蜡（5658）50min； 2.2.7 包埋组织块经过浸透剂浸透后，再用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋。不同的包埋方法有不同的要求，包埋后均可制成组织的块。经过包埋后，可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。具体方法如下：将溶化的硬蜡（6062）倾入特制的包埋框内，倒
12、满为止，迅速将浸蜡缸中的胸腺组织放入包埋框底部中央，将标签分别放在蜡块上，待表层蜡凝结后，可放在冰冻台上，加速其凝固，待蜡块完全冷却凝固后拆除包埋框，取出蜡块，包埋即完成。2.2.8 切片石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介制作切片的。切片前需对蜡块进行处理，即修切蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般留下至少约2mm宽度的蜡边为宜。注意蜡块不能留得太窄，在切片时易损坏组织；蜡边不能留得太多，否则影响展片。室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。将修切好的蜡块迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可
13、用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度（图七）。切片时，用力要均匀一致，不宜过重或过猛，否则容易造成切片厚薄不均匀，甚至毁坏蜡块。通常切片厚度为47微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上（图八）。图七 切片机(microtome) 图八 切片(slice)2.2.9 粘片与烘片粘片的目的是将石蜡切片粘附在载玻片上，借水的张力和一定的温度，使略皱的蜡片伸展平整，以便染色和镜检。一般有水捞法和干粘法。本实验采用水捞法：将一个盛水的容器加热至35-40，将蜡带光泽面向下铺于温水上，让其自然展开。待蜡片伸展平整后，即可用长镊子分离每一个蜡片，再用载玻片伸入水中，从蜡片下面捞起，使展开的组织贴于载
14、玻片上（图九）。把玻片摆好片位置（图十），在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展，或放置置于预先加热的展片台上（温度保持在 4045）。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37温箱烘干，一昼夜干燥于切片盒待染。 图九 贴片(patch) 2.2.10 脱蜡复水 石蜡切片经二甲苯、脱蜡各510min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各35min，再放入蒸馏水中3min。染色液多数为水溶性的，因此，染色前必须将石蜡脱去，使水相进入切片组织中。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，
15、由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。2.2.11 染色 切片放入苏木精中染色约1030min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。水洗：用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。漂洗：切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水
16、中漂洗一次。脱水：切片入50%70%80%的乙醇溶液中各35min。复染：用0.5%伊红乙醇液对比染色25min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。脱水：放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中35min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。透明：切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯、中各35min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换（图十），或用纱布包无水硫酸铜放入染色
17、缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检（图十一）。图十 脱蜡复水(dewaxingrehydration ) 图十一 透明(transparence)封片：封藏于中性树胶中，使材料能在显微镜下清晰地显示出来，并能长期保存。将含材料的载玻片放在吸水纸上（切片一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（必须在二甲苯干燥前进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地放下，避免产生气泡。3 结果与分析鸡腿肌切片图（十二、十三）图十二 鸡腿肌HE染色 1010 图十三 标准鸡腿肌 HE染色 1040 4.
18、讨论 通过这次石蜡切片整个的制作过程，我深刻体会到石蜡切片的制作是一个看似简单，其实并非想象那么容易的工作。要制备一张高质量的石蜡切片，必须处理好每一个实验细节并及时合理的解决实验出现的问题。掌握好这门基础实验技术对以后的学习工作有很重要的意义。下面这些是制作中的注意事项：取材的注意事项： a.取材一定要新鲜，即迅速宰杀的动物的相应组织提取组织，不宜作太久的拖延以免组织细胞的构成（图一）、蛋白变性坏死。b.切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。c.取材后衔接方面，应立即放入固定液中固定，避免标本里蛋白变性或细胞成分改变。脱水注意事项：a.脱水必须在有盖的玻璃品中进行
19、，防止酒精挥发导致浓度降低。b.在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。c.在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软。d.在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。e.如需过夜，应停留在70%酒精中。f.脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象透明注意事项：a.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。b.更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。c.在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明图（六）。透蜡注意事项：a.尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度。温度过高会引起组织变硬变脆而收缩；温度过低石蜡不能够完全溶化，难以均与渗透到组织内部，造成组织与石蜡脱离，蜡块中出现气泡、裂缝； b.透蜡温度要恒定，不可忽高忽低； c.操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。