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1、1,受体的放射性配体结合分析 radioligand binding assay of receptors, RBA,2,受体（receptor）是细胞膜上或细胞内的一些能与生物活性物质相互作用并引起特异性生物效应的物质。 受体与其配体（ligand）结合后，通过受体特定的信号传导系统，引起细胞的特定反应，是高等动物适应环境、协调机体各种细胞功能的关键性分子。,3,受体的放射性配体结合分析（radioligand binding assay of receptors，RBA）是用放射性核素标记的配体与相应的受体进行特异性结合反应，从而对受体进行定性或定量分析。,放射性配体,+,受体分子,受体配
2、体 复合物,分离B与F,测定，计算受体数量及亲和力,4,定量RBA是在已知配体与受体反应的基础上，通过结合反应得知一定数量的组织或细胞与该放射性配体结合的受体数量，即结合位点数。配体与受体的亲和力以结合反应的平衡解离常数表示。 定性RBA则通过反应量效关系、某些参数的变化等判断受体的类型、结合方式（单位点系统或多位点系统）、受体与配体相互作用特点等。,5,一、RBA的主要优点,1、高灵敏度 2、特异性强、专一性好 3、受体制剂的多用性,6,二、受体的分类,膜受体 核受体,7,（一）膜受体,由胞膜外、胞膜内、跨膜区组成。按跨膜区又可分为： 1、G蛋白偶联受体（神经递质、前列腺素等） 2、单一跨膜
3、区有激酶活性受体（细胞因子） 3、单一跨膜区无激酶活性受体（生长因子、INS） 4、离子通道型受体（Na+、K+、Cl-、Ca+等）,8,9,2、核受体 受体在细胞核上，通过与细胞核内特定的DNA结合后影响遗传信息的转录。核受体一般是由4001,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质。氨基端是高度可变区，与转录的特异性有关。中间是DNA结合区，富含半胱氨酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌指”与DNA结合；该区域部位保守性强。羧基端为激素结合区。 糖皮质激素受体类、性激素受体类、甲状腺激素受体类。,10,三、受体与其配基作用的特点,1可饱和性 2可逆性 3、特异性和亲和力 4生物效应的一致
4、性 5. 需具有内源性配体,11,1可饱和性 每个细胞所含的受体数目有限，故配体与受体的结合反应具有可饱和性，呈高亲和力和低容量。 2、可逆性 配体与受体的结合是可逆的，当受体周围配体浓度降低，结合反应就逆向进行，即配体与受体解离，解离后的配体是原形，不起代谢变化。,12,3、特异性和亲和力 受体有特异识别配体的作用，只有严格构型和构象的配体才能选择性地与某受体结合。受体的特异性还表现在器官或组织的专一性。受体的亲和力表明其与配体的结合能力，高亲和力说明受体配体结合牢固。平衡解离常数在10-9mol/L以上的被认为高亲和力受体。,13,4生物效应的一致性 受体的主要功能是介导配体的生物效应，如
5、一种蛋白质与某种物质结合而不介导特定生物效应，则此蛋白质不能称之为受体。 5. 需具有内源性配体 受体都需有内源性配体，如果通过外源性配体发现某种蛋白质分子具有类似受体的特性，但未找到内源性配体，则称之为孤儿受体，不能认为是真正的受体。,14,四、单位点系统RBA的基本原理,1、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律 不少受体与配体结合的系统只存在一种结合位点，即简单单位点系统，其基本规律符合质量作用定律。 质量作用定律,15,1=1RL， 2=2RL 平衡时：1RL= 2RL 则平衡解离常数： KD=2/1=R.L/RL KD是平衡解离常数,为平衡亲和常数KA的倒数，单位为mol/L，KD
6、越大表示亲和力越低。,16,设受体和配体的初始浓度为RT和LT,R=RT-RL，L=LT-RL，则： 经整理后得： RL2 RLRT + LT + KD + RTLT= 0 对特定配体和某一固定量的特定受体，RT和KD均是定值，于是RL仅随LT而变，二者呈双曲线函数关系。,17,2、饱和曲线 简单单位点系统RBA应能得到典型的饱和曲线。以RL为纵坐标，LT为横坐标，得到RL随LT变化的曲线。配体的浓度从零开始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大部分受体都与配体结合，即受体饱和了。此就是饱和曲线。 饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配体结合。,18,19,（1）总结合（tot
7、al binding，TB）,受体与标记配体结合时，测量得到的放射性还含有一部分（反应管壁吸附、杂蛋白吸附、分离不完全等）未与受体结合的标记配体的放射性，需将此部分减去才能得到特异结合计数。,20,（2）非特异结合 （non-specific binding，NSB）,放射性配体除与受体特异性结合外，尚可与其他成分结合，称之为NSB。主要来自杂蛋白、反应器壁、分离材料的吸附等。特点是结合容量大而亲和力小，不会出现饱和现象，结合量与所使用的配体量呈线性关系。 常做一系列平行管，条件与TB相同，多加200 1000倍非标记配体以取代标记配体与受体结合，测得的即NSB。,21,（3）特异结合 （sp
8、ecific binding，SB）,受体与标记配体结合的放射性计数，无法直接获得。常用相同浓度的TB减去NSB求得。,22,TB,SB,NSB,23,五、离体RBA的基本方法,制备待测受体的离体标本,加放射性配体温育一定时间,终止反应、分离结合与游离部分,测定结合部分的放射性,数据处理、求出有关参数,24,（一）基本试剂及制备,1、受体样本 2、放射标记配基 3、非标记配基,25,1、待测受体标本的制备,用于离体RBA的标本大体可分为组织切片、完整细胞悬液、经初步分离的细胞组分及经增溶或进一步纯化的受体蛋白等。,26,1）组织切片 为保持受体活性，常用冷冻组织切片，厚度550 m，将其贴于涂
9、有明胶的玻片上，在温育缓冲液中与标记配体进行反应。反应后洗去游离部分。可刮下切片测量其放射性活度，也可用放射自显影或免疫组化研究受体分布。,27,2）完整细胞悬液的制备 血细胞可用通常分离血中有形成分的方法分离。 从组织中分离细胞一般是用胶原酶处理组织，再将游离的细胞分离出来。 用完整细胞进行RBA的主要优点是可同时观察配体与受体结合的情况和细胞的生物效应，得到的结果更能反映受体的生理特性。此外，还可直接给出平均每个细胞的受体数目。缺点是在处理过程中有时可能导致细胞表面生理活性的改变。有时受体在细胞中的含量很低，则需用较大量的细胞才能作一次实验。,28,3）细胞组分的分离 组织匀浆多数RBA使
10、用细胞组分进行分析。其优点是：去除了大部分杂蛋白和内源性配体，减少NSB或其他因素的干扰；受体蛋白得到初步浓缩，受体制剂的富集可获得可靠的实验结果。,29,组织匀浆,沉淀：完整细胞、核受体,上清液,8003500g, 1015 min,沉淀：线粒体，膜受体,上清液,10,000300,000g, 1015 min,沉淀：微粒体,上清液：浆受体,10,000300,000g, 1015 min,30,2、放射标记配基,1）高亲和力、高特异性 2）高稳定性 3）高比活度 4）高放化纯,31,3、非标记配基,用来设立NSB，可以与标记配基同一物质，也可不同，但必须与受体结合有高亲和力。,32,（二）
11、温育条件,1、缓冲液 2、时间与温度,33,（三）分离,分离的目的是将已形成的放射性复合物与游离的放射性配体分开，测定其复合物放射性。一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此在分离过程中要使复合物的解离降低到最低程度，低温和快速是最有效的措施。 常用的分离方法有： 1、平衡透析法； 2、离心法 3、过滤法,34,六、定量RBA的数据处理,定量RBA主要是通过测得的样品的数据及所用标记配体的量和比活度，通过数学模型进行运算，得出受体的有关参数RT、KD等。,35,1、单点法,仅取一个浓度点的标记配体，标记配体的量可使受体饱和并略有剩余（过量）。 该法操作简便，标本用量少，但只能给出受体的最大结合位点
12、数（RT），无法得了该配体与受体的亲和力（KD）。,36,单点法RBA的数据处理,(1)从实验所得到的总结合TB减去非特异性结合NSB的平均放射性计数（cpm）得到特异性结合RL的cpm。 (2)根据仪器测量效率将RL的cpm换算成dpm, 用配体的比活度再换算成mol。 (3)受体与配体的结合按1：1形成复合物，则RL的mol即为受体结合位点的mol数。,37,(4)另取一定量的样品测蛋白含量或细胞数，即可算成一定量蛋白或一定细胞数中RT的mol数,即为RT。 (5)还可进一步将mol换算成分子数（1 mol=6.021023个分子），从而得到单位细胞或单位蛋白的受体结合位点数。,38,此式
13、中受体与配体为1：1关系，如受体与配体以1：2关系形成复合物，则上式应被2除。对于完整细胞，则按细胞数进行计算，以mol/106细胞或受体位点数/106细胞表示。,39,例,实验室进行外周血WBC的GCR分析，测得TB为4500cpm，NSB为2500cpm，3H-Dex的SA为1.851012Bq/mmol，蛋白量为1mg，液闪的Eff=30% SB=TB-NSB=4500-2500=2000cpm 2000/（0.3601.8510121）=60fmol/mg,40,1mol=6.021023分子 60fmol/mg= 6010-156.021023=3.61010受体/mg蛋白 若：WB
14、C细胞数为7.5106个，则 RT=3.61010/ 7.5106=4800受体/细胞,41,2、多点法,多点法实验可分简单单位点和双（多）位点两部分。常用多点饱和曲线法：即每一受体标本做68个标记配体浓度点（多位点所需浓度点更多），标记配体的用量应覆盖受体的饱和区和不饱和曲，以得到饱和曲线。 数据处理是将数学模型直线化，再将测得数据进行直线拟合，求出所需参数。计算机普及后，人们用计算机进行曲线拟合，以减少直线化带来的误差。,42,Scatchard作图 简单单位点系统在Scatchard作图中应呈一条直线。 以RL/L对RL作图，即为Scatchard作图。在简单单位点系统，应得一直线。斜率
15、是 -1/KD，而直线与横轴的交点则等于RT值。,43,44,例： 实验室做外周血WBC的GCR多点分析，3H-Dex的SA为38.0Ci/mmol，放化纯为99%，配成工作浓度10uCi/ml.,45,1、加样程序,46,2、测量结果,47,3、建立NSB的回归方程,以NSB管的cpm对3H-Dex的体积数（10、20、25、3040、50）建立回归方程，得到： Y=52.5456X+45.7007（r=0.9997） 将未做的NSB管对应的3H-Dex体积（20、40）代入方程，得到NSB各管值。 （10、571）；（20、1097）；（25、1359）；（30、1622）；（40、214
16、8）；（50、2673）,48,4、计算B、F和B/F,49,5、换算B相对应的3H-Dex 物质量,比放= SA为38.0Ci/mmol，放化纯为99%，Eff=42% 1、38Ci/mmol=38uCi/nmol=1.406106Bq/nmol 2、1nmol=1.406106Bq0.99=1.4202106Bq 3、1cpm=1/(0.4260)=0.03968Bq =0.03968/(1. 4202106Bq)=0.0282fmol,50,换算B对应的fmol数,1215cpm-34.26（fmol） 1702cpm-48.00 （fmol） 1963cpm-55.36 （fmol）
17、2005cpm-56.54（fmol） 2087cpm-58.85 （fmol） 2067cpm-58.30 （fmol） 以B对应的fmol数为横坐标，B/F为纵坐标进行Scatchard作图,51,6、Scatchard作图,52,7、计算RT和KD,y=0时，对应的为RT 即 RT=0.01542/0.0001972=78.195fmol 如果细胞数为7.5106个，则 RT=6276个受体/细胞 截距=RT/KD，故KD=RT/截距 截距为X=0时的y值，故： KD=RT/0.01542=5.07nM,53,六、RBA的应用价值,1、受体与疾病 2、受体与肿瘤 3、受体在药物研究中的应用价值 1）在药物作用机制中的作用 2）在观察药物毒副作用中的应用,54,4、受体-配体介导的靶向诊断与治疗,55,思考题,1、什么是受体？什么是RBA？RBA的优点？ 2、受体的分类、受体与配体作用于特点？ 3、什么是饱和曲线、TB、NSB、SB？ 4、单点法RBA的数据处理。,