人参皂苷RG3抗人肝癌细胞株侵袭和转移的实验研究.pdf

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1、人参皂苷 Rg3 抗人肝癌细胞株侵袭和 转移的实验研究 华海清1 沈小昆2 秦叔逵1 陈惠英1 1. 解放军第八一医院全军肿瘤中心， 江苏南京 210002； 2. 南京市鼓楼医院呼吸科， 江苏南京 2100029 摘要 目的： 探讨人参皂苷 Rg3 抗人肝癌细胞侵袭和转移的作用及其相关机制。方法： 选择人类肝癌细胞 株 SMMC-7721 细胞和建株人脐静脉内皮细胞株 ECV304 作为研究对象， 通过细胞抑制实验 （MTT 法） 、 细胞粘附试 验和免疫组化方法系统地观察人参皂苷 Rg3 体外对 SMMC-7721 细胞及 ECV304 细胞生长的抑制作用、 SMMC-7721 细胞与纤维

2、粘连蛋白 （FN） 粘附以及表达 nm23、 CD44、 VEGF 基因蛋白的影响。结果： 人参皂苷 Rg3 能够显著地抑 制肝癌细胞株 SMMC-7721 细胞及内皮细胞株 ECV304 的生长， 抑制 SMMC-7721 细胞与 FN 粘附及 CD44、 VEGF 的 表达， 而增强 nm23 基因的表达。结论： 人参皂苷 Rg3 具有抗人肝癌细胞侵袭和转移的作用， 机制可能与其能够抑 制肝癌细胞侵袭活力、 调节与肝癌细胞侵袭与转移密切相关的基因表达和抗肿瘤血管形成有关。 关键词 人参皂苷 Rg3； 肝癌细胞； 内皮细胞； 侵袭； 转移； CD44； nm23； VEGF 中图分类号： R

3、735. 7 文献标识码： A 文章编号： 1007-3639 （2005） 04-0326-05 Anti-invasion and anti-metastasis effects of ginsenoside Rg3 on the hepatocellular carcinoma cell line HUA Hai-qing , SHEN Xiao-kun, QIN Shu-kui, et al ( Department of Medical Oncology of PLA Cancer Center, The 81st Hospital of PLA, Nanjing Jiangsu 2

4、10002, China) Abstract Purpose To explore the effects and mechanisms of anti-invasion and anti-metastasis of ginsenoside Rg3 on human hepatocellular carcinoma cells. Methods To select human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 and the human allantoic veins endothelial cell line ECV304 as the

5、 study objects. We observed the effet of ginsenoside Rg3 s effect on the growth of SMMC-7721 and ECV304 by MTT methods, the adhesion of SMMC-7721 and Fibronectin by cell adhesion experiment, the expression of gene protein of nm23, CD44 and VEGF by immunohisto-chemical method. Results Ginsen- oside R

6、g3 could inhibit not only the growth of SMMC-7721 and ECV304 significantly, but also the adhesion of SMMC-7721 and FN. It might also down-regulate the expression of CD44, VEGF and up-regulate the nm 23 gene expression. Conclu- sions Ginsenoside Rg3 can inhibit invasion and metastasis of the hepatic

7、carcinoma cell. The mechanisms are probably that Ginsenoside Rg3 can inhibit the hepatic carcinoma cells invasion activity, regulate the expression of the gene proteins which are closely related with invasion and metastasis , inhibit neovasularization. Key words ginsenoside Rg3; hepatocellular carci

8、noma cell; endotheliocyte; invasion; metastasis; CD44; nm23; VEGF 第一作者简介： 华海清， 男， 博士， 主任医师。长期从事中西医结合治 疗恶性肿瘤研究。 E-mail： qinsk csco. org. cn 人参皂苷 Rg3 是名贵中药人参所含的最重要 的有效成分之一， 国内外学者的研究均发现该成分 具有明显的抗肿瘤作用。近年来， 在我国 Rg3 单体 的提取工艺获得了重大突破， 研制出了现代中药制 剂参一胶囊， 经过一系列临床试验， 业已作为国家一 类抗癌新药上市， 用于肺癌、 肝癌等恶性肿瘤的辅助 治疗。为了深入探讨人参

9、皂苷 Rg3 抗肿瘤侵袭和 转移的作用及其相关机制， 我们选用人类肝癌细胞 株 SMMC-7721 细胞和建株人脐静脉内皮细胞株 ECV304 为研究对象， 系统地观察了人参皂苷 Rg3 对于 SMMC-7721 细胞和 ECV304 细胞生长的影响、 SMMC-7721 细胞与纤维粘连蛋白 （FN） 粘附以及表 达 nm23、 CD44、 VEGF 基因蛋白的影响。 1 材料和方法 1. 1 细胞株与药品 人类肝癌细胞株 SMMC-7221 细胞和建株人脐静脉内皮细胞株 （ECV304） ， 均引 自中国科学院上海细胞生物研究所。人参皂苷 Rg3 纯品， 由 吉 林 亚 泰 制 药 有 限

10、公 司 惠 赠 （ 批 号： 200053） ， 使用前以二甲基亚砜 （DMSO） 溶解， 用 RPMI-1640 培养液稀释至所需浓度； 而 DMSO 对照 623 中国癌症杂志2005 年第 15 卷第 4 期 CHINA ONCOLOGY 2005 Vol. 15 No. 4 组含相应浓度的 DMSO 而不含 Rg3。胰蛋白酶为美 国 Difco 公司产品。小牛血清系杭州四季青生物工 程公司产品。MTT 试剂为美国 Fluka 公司产品。鼠 抗人 CD44 单克隆抗体、 鼠抗人 nm23 单克隆抗体、 鼠抗人 VEGF 单克隆抗体、 超敏 SP （鼠） 试剂盒为美 国 Maxim Bio

11、tech Inc. 公司产品。液体 DAB 酶底物 显色试剂盒为福建迈新生物技术开发公司产品。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 细胞培养 SMMC-7721 细胞和 ECV304 细 胞接种于无菌培养瓶中， 加入适量 RPMI-1640 培养 液 （含 10% 的小牛血清、 青霉素 100 u/ ml、 链霉素 100 g/ ml） ， 于 37、 5% CO2及饱和湿度的培养箱 中培养。细胞呈单纯贴壁生长， 每 3 5 天传代一 次。传代时用 0. 25% 胰蛋白酶消化 2 3 分钟， 用 培养液吹打制成细胞悬液， 按所需浓度接种。 1.2. 2 形态学观察 实验时将对数生长期的细胞 按

12、 1. 0 106/ ml 接种于培养瓶中， 待细胞完全贴壁 后 （约 4 5 小时） ， 给药组加入不同浓度的药物， 对 照组加入等体积的培养液， 培养至预定时间， 用倒置 显微镜观察细胞生长状况和形态学改变。 1. 2. 3 MTT 比色法 取 3. 0 104/ ml 的细胞接种 于 96 孔培养板中， 每孔 100 l， 设 4 复孔， 待细胞贴 壁后 （4 5 小时） ， 加入不同浓度的 Rg3 及 DSMO 100 l/ 孔， 对照孔加入 100 l 培养液， 置于 37、 5%CO2的培养箱中培养至预定时间， 每孔加入 5 mg/ ml 的 MTT 20 l， 继续培养 4 小时

13、， 弃去全部上 清液， 每孔加入 100 l 0. 04 mol/ L 盐酸异丙醇， 微 型振荡器振荡 5 10 分钟使结晶完全溶解， 在酶联 仪波长 570 nm 处测出用药后 24、 48、 72 小时各孔吸 光度值 （A） 。实验共重复 3 次， 按下列公式计算细 胞生长抑制率： 抑制率 （%）= （1-加药孔平均 A 值/ 对照孔平 均 A 值）100%。 1. 2. 4 SMMC-7721 细胞与纤维连接蛋白 （Fibrone- ctin，FN） 的粘附实验 取 70 g / ml 的 FN 包被 96 孔板， 每孔 30 l， 在超净台风干后放入 4 冰箱中 备用。实验时取 1 1

14、06/ ml 的 SMMC-7721 细胞接 种于已包被 FN 的 96 孔培养板中， 每孔 100 l， 设 4 复孔， 待细胞贴壁后 （4 5 小时） ， 加入浓度分别为 62. 5、 125、 250 g/ ml 的人参皂苷 Rg3 100 l， 对照 组加入 100 l 培养液， 置于 37、 5% CO2的培养箱 内分别温育 20、 40、 60、 120 分钟， 吸出培养液， 每孔 加入 5 mg/ ml 的 MTT 20 l， 继续培养 4 小时， 弃去 全部上清液， 每孔加入 100 l 0. 04 mol/ L 盐酸异丙 醇， 微型振荡器振荡 5 10 分钟， 使结晶完全溶解

15、， 在酶联仪波长 570nm 处测出各孔吸光度值 （A） ， 以 A 值代表粘附细胞数， 按下列公式计算细胞粘附抑 制率： 抑制率 （%）= 1- （加药孔平均 A 值 - 空白孔 平均 A 值） / （对照孔平均 A 值 - 空白孔平均 A 值） 100%。 1.2. 5 免疫组化检测 收集与人参皂苷 Rg3 （终浓 度为 125 g/ ml） 共同温育了 48 小时的 SMMC-7721 细胞， 涂片， 风干， 4纯丙酮固定， 晾干。每张涂片 加 50 l 过氧化酶溶液以阻断内源性过氧化酶的活 性， 室温下温育 10 分钟， PBS 冲洗 3 次， 每次 5 分 钟； 每张涂片加 50 l

16、 的非免疫性动物血清， 室温下 温育 10 分钟； 吸去多余的液体， 每张涂片加 50 l 的一抗 （VEGF、 nm23、 CD44） ， 室温下温育 1 小时， PBS 冲洗 3 次， 每次 5 分钟； 每张涂片加 50 l 生物 素标记的二抗， 室温下温育 10 分钟， PBS 冲洗 3 次， 每次 5 分钟； 每张涂片加 50 l 链酶菌抗生物素蛋 白-过氧化酶溶液， 室温下温育 10 分钟， PBS 冲洗 3 次， 每次 5 分钟； 每张涂片加 100 l 新鲜配制的 DAB 溶液， 显微镜下观察 3 10 分钟， 自来水冲洗， 苏木素复染， 中性树胶封固， 镜检。采用已知阳性切 片

17、作阳性对照， 用 PBS 代替一抗作阴性对照。阳性 判断： 以胞质和 （或） 胞膜呈棕黄色为阳性细胞， 油 镜下观察 200 个细胞， 计算阳性细胞百分率。阳性 率 50%为 （ + + + ） 。 1.3 统计处理 应用 SPSS10. 0 统计软件进行相关 资料处理， 采用方差分析和 q 检验。 2 结 果 2. 1 形态学观察 倒置显微镜下观察， 人参皂苷 Rg3 可以明显抑制人肝癌细胞株 SMMC-7721 和建 株人脐静脉内皮细胞 ECV304 的生长。随着与 Rg3 温育时间的延长， 上述细胞的增殖逐渐受到抑制， 细 胞形态逐渐变圆， 脱壁； 细胞间接触松散， 胞质中颗粒 增多，

18、细胞周围出现碎片， 部分细胞死亡后漂浮在培 养液中。高浓度组较低浓度组更为明显， 而未用药的 对照组细胞呈上皮型贴壁生长， 细胞轮廓清楚， 细胞 间接触紧密， 胞质中无异常颗粒出现， 增殖旺盛。 2. 2 人参皂苷 Rg3 对 SMMC-7721 及 ECV304 细 胞生长的影响 （MTT 法） 各浓度组的人参皂苷 Rg3 对人肝癌细胞株 SMMC-7721 细胞及 ECV304 细胞的抑制作用， 强于相应浓度的人参皂苷 Rg3 溶 723中国癌症杂志2005 年第 15 卷第 4 期 解液 MDSO， 经统计处理， 差异有显著性 （前者 P 0.05）（见表1、 表2） 。 表 1 人参皂

19、苷 Rg3 作用不同时间对 SMMC-7721 细胞生 长的抑制率（n =3， %） 药物浓度 （g/ ml）24 h48 h72 h Rg331. 2522.20 2.9445.17 1.5056.00 1.04 62. 5028.93 5.0553.07 3.9159.30 1.27 125. 032.33 7.7454.03 1.5065.03 2.14 250. 057.70 2.9467.30 1.5674.10 1.04 500. 062.40 2.6075.23 1.5083.10 1.04 DMSO0. 46912.00 2.9421.30 1.5634.30 1.04 0.

20、93815.40 2.9427.50 1.5637.90 2.08 1. 87523.90 0.0038.10 1.5650.00 1.04 3. 75034.03 8.7844.30 0.0053.60 2.08 7. 50037.40 7.7951.40 1.5663.20 1.04 Rg3 各浓度组与 DMSO 各相应浓度组比较， P 0.05。 表 2 人参皂苷 Rg3 作用不同时间对 ECV304 细胞生长的 抑制率（n =3， %） 药物浓度 （g/ ml）24 h48 h72 h Rg331. 250.00 0.005.07 4.6419.87 1.15 62. 508.00 4

21、.0013.13 1.7921.83 1.10 125. 012.00 0.0024.20 0.0028.87 5.08 250. 034.67 12.2240.33 1.6251.27 1.10 500. 046.67 2.3154.53 3.0568.57 1.10 DMSO0. 4691.33 2.313.03 3.0510.87 1.10 0. 9381.33 2.3112.10 0.0014.13 1.10 1. 8754.00 0.0015.17 3.0519.27 3.35 3. 75014.67 6.1120.20 1.7338.50 0.00 7. 50026.67 6.11

22、34.33 1.7952.53 1.10 Rg3 各浓度组与 DMSO 各相应浓度组比较， P 0.05。 2. 3 人参皂苷 Rg3 对 SMMC-7721 细胞与 FN 粘 附的影响 由表 3 可见， 人参皂苷 Rg3 有明显的抑 制 SMMC-7721 细胞与 FN 粘附的作用， 各浓度组的 抑制率与相应浓度的 DMSO 相比， 均有显著差异 （P 0. 01） ； 人参皂苷 Rg3 相同浓度作用不同时间或 作用相同时间浓度不同的抑制率亦有显著差异 （P 0. 01） ， 即 Rg3 剂量增加， 作用时间长， 其抑制率 就越高。 2. 4 人参皂苷 Rg3 对 SMMC-7721 细胞

23、CD44、 nm23 和 VEGF 表达的影响 细胞免疫化学研究结 果： SMMC-7721 细胞未加药时， 细胞粘附分子 CD44 呈强阳性表达 （ + + + ） ， 抑癌基因 nm23 呈阴性表 达 （ - ） ， 血管内皮生长因子 VEGF 呈强阳性表达 （ + + + ） ， 经125 g/ ml 的人参皂苷 Rg3 作用48 小 时后， CD44 表达减弱 （ + ） ， nm23 则表达增强 （ + + + ） ， VEGF 表达亦减弱 （ + ）（见图 1 6） 。 表 3 人参皂苷 Rg3 作用不同时间对 SMMC-7721 细胞与 FN 粘附的抑制率（n =4， %） 药物

24、 浓度 （g/ ml） 20 min40 min60 min120 min Rg362.5021.17 1.8529.27 2.4536.10 2.5541.13 2.31 125.023.30 3.2035.73 2.8342.80 3.4848.23 0.75 250.031.83 4.8938.20 1.3948.33 1.6552.67 0.75 DMSO0.3132.00 1.910.80 2.462.77 0.928.07 0.81 0.6256.27 1.794.87 2.465.00 1.709.40 1.56 1.259.43 3.706.50 1.398.87 0.9813

25、.03 3.56 Rg3 各浓度组与 DMSO 各相应浓度组比较， P 0. 01； Rg3 相同浓度 作用不同时间或作用相同时间浓度不同各组 P 0. 01。 图 1 免疫组化 SMMC-7721 细胞未加药组 CD44 呈强阳性 表达 （ 200） 图 2 免疫组化 SMMC-7721 细胞加药组 CD44 表达减弱 （ +） （ 200） 图 3 免疫组化 SMMC-7721 细胞未加药组 nm23 呈阴性表 达 （ -） （ 200） 823华海清， 等 . 人参皂苷 Rg3 抗人肝癌细胞株侵袭和转移的实验研究 图 4 免疫组化 SMMC-7721 细胞加药组 nm23 呈阳强性表 达

26、 （ + + +） （ 200） 图 5 免疫组化 SMMC-7721 细胞未加药组 VEGF 呈强阳 性表达 （ + + +） （ 200） 图 6 免疫组化 SMMC-7721 细胞加药组 VEGF 表达减弱 （ +） （ 200） 3 讨 论 近年来， 中药有效成分抗肿瘤的研究受到国内 外学术界的重视与关注。人参皂苷 Rg3 （ginsen- oside， Rg3） 是从人参中分离提纯的一种单体， 为四 环三萜类人参二醇型皂苷， 药理实验表明， Rg3 具有 抗疲劳、 提高免疫力、 扩张血管、 抑制血小板聚集、 保 护神经细胞等多种作用， 特别是抗肿瘤侵袭与转移 的作用， 近年来研究发现

27、可能与抑制癌细胞对血管 壁基底膜及周围组织的浸润和转移活性等有关 1。 纤维连接蛋白 （fibronectin， FN） 为基底膜及细 胞外基质的重要成分， 肿瘤细胞从母体脱离后， 侵袭 基底膜及细胞外基质， 通过膜表面受体可粘附于 FN 上而产生运动与迁移， 使肿瘤扩散与转移。Mochi- zuki 等 2在体外细胞实验中发现， 人参皂苷 Rg3 能 显著抑制 B16-BL6 黑色素瘤细胞与 FN 及层连蛋白 （lamini， LN） 的粘附及对基底膜的侵袭， 且与剂量呈 相关性。本实验结果显示， 人参皂苷 Rg3 能抗 SMMC-7721 细胞与 FN 粘附， 抑制 SMMC-7721 细

28、胞 在 FN 上的迁移运动， 这种作用随剂量的增加而增 强， 且与作用时间呈正相关。二甲基亚砜 （DMSO） 是一种抗冻剂， 用于冻存细胞； DMSO 还可以诱导 Hela 细胞分化阻滞细胞于 G1期。因人参皂苷 Rg3 不溶于水， 只溶解于 DMSO， 故本研究采用 DMSO 来 溶解人参皂苷 Rg3 粉末。DMSO 本身对 SMMC-7721 细胞亦有较高的抑制作用， 但各相应浓度组与人参 皂苷 Rg3 组比较差异仍具有显著性 （P 0. 01） ， 提 示人参皂苷 Rg3 有可能通过抑制 SMMC-7721 细胞 的生长活力、 抑制肿瘤细胞与 FN 粘附而发挥抗侵 袭作用。 CD44 和

29、 nm23 均是与肿瘤侵袭与转移密切相 关的基因蛋白。CD44 是存在于细胞表面的跨膜糖 蛋白， 是介导转移的主要粘附分子， 主要参与细胞与 细胞、 细胞与基质之间的特异性粘附 3， 其表达可 能与肝细胞癌的血管浸润潜能密切相关 4。nm23 （non-metastasis 23） 则属于肿瘤转移抑制基因， 其基 因编码的蛋白产物为核苷二磷酸激酶 （NDPK） ， 此 酶参与体内多种生物学过程如三磷酸核苷的合成 等， 此酶的异常改变可引起由微管聚合而成的纺锤 体的异常， 并可通过细胞骨架及细胞素等信号的反 应性改变引起细胞运动而参与肿瘤的浸润和转移过 程。已有研究 5， 6表明， 在乳腺癌、

30、胃癌、 甲状腺癌、 肝癌以及卵巢癌等恶性肿瘤中， nm23 基因及其产物 均呈低表达， 同时与疾病的进展和高转移潜力呈明 显负相关； 体外研究也显示 7， nm23H1 能够降低 SMMC-7721 肝癌细胞在体外的转移潜能。本实验 发现， 人参皂苷 Rg3 能抑制 SMMC-7721 细胞 CD44 的表达， 促进 nm23 的表达， 提示人参皂苷 Rg3 有可 能通过调节肿瘤组织某些与侵袭与转移相关基因蛋 白的表达而发挥抗粘附和侵袭转移作用。 VEGF （vascular endothelial growth factor， VEGF） 为血管内皮生长因子， 它对血管内皮细胞的增殖、 迁

31、移、 水解基膜和构建血管的调控作用较强， 能促进肿 瘤血管形成， 因而与肿瘤的生长、 侵袭及转移关系密 切。Brown 等 8报道， VEGF 的阳性患者中 50% 有 肝转移， VEGF 阴性者无 1 例有肝转移。李晓明 等 9发现， 肝癌组织 VEGFmRNA 表达水平， 癌栓组 923中国癌症杂志2005 年第 15 卷第 4 期 高于无癌栓组 （P 0. 05） ， 胞膜不完整组高于胞膜 完整组 （P 0. 05） ， 提示 VEGF 的高表达容易导致 肝癌细胞的侵袭与转移。它如乳腺癌、 脑肿瘤、 卵巢 肿瘤、 黑色素瘤、 肺癌及大肠癌等的肿瘤生长无不与 VEGF 的表达密切相关 10

32、， 11. 有报道12 14， 人参皂 苷 Rg3 对肺癌细胞、 胃癌细胞条件培养液诱导的内 皮细胞增殖具有抑制作用， 对荷卵巢癌 SCID 鼠腹 腔移植瘤 VEGF 的表达有下调作用。高勇等 15， 16 研究发现， 人参皂苷 Rg3 可抑制鸡胚绒毛尿囊膜 （CAM） 血管形成， 其抗肿瘤作用可能与抑制肿瘤组 织表达 bFGF 有关。本实验结果显示， 人参皂苷 Rg3 抗肿瘤血管形成有可能与抑制血管内皮细胞生长及 抑制肿瘤细胞表达 VEGF 有关。 综上所述， 人参皂苷 Rg3 作为我国第一个中药 单体抗癌新药， 文献 17， 18和细胞实验均证实有一定 的抗肿瘤转移作用， 同时我们在动物实

33、验上亦发现 有抗肿瘤侵袭转移作用； 在临床上我们试用于肝癌、 肺癌、 胃癌等抗转移治疗显示出较好效果， 值得今后 作进一步深入研究。 参 考 文 献 1 Lishi H， Tatsuta M，Uehara， et al. Inhibition by ginsenoside Rg3 of bombesin-enhanced peritoneal metastasis of intestinal adeno- car-ciomas induced by azoxymethane in Wister rats J . Clin Exp Metastasis， 1997， 15 （6） ： 603.

34、2 Mochizuki M，Yoo YC，Matsuzawa K， et al. Inhibition by Gim- sennoside Rg3 of bombesin-enhanced peritoneal metastasis of intstinal adencarcinomas induced by azoxymethane in Winstar rats J . Clin Exp Metastasis， 1997， 15 （6） ： 603-611. 3 Gunthert U，Lotraine N，Summer E，et al. Are CD44 vatrant isoforms

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