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1、 临床遗传学研究 定位于 12q24 的腓骨肌萎缩症 2L 型 10 个候选 基因的排除克隆 张如旭唐北沙资晓宏罗巍夏昆潘乾胡政茂赵国华郭科 【摘要】 目的克隆定位于 12 号染色体微卫星标记 D12S1720 和 D12S1611 之间约 6.8 cM 的区间内的 腓骨肌萎缩症 2L 型的致病基因。方法应用生物信息学方法筛选 10 个候选基因， 设计合成扩增 10 个基 因外显子及外显子与内含子交界的引物， DNA 直接测序法进行序列变异分析。结果在基因外显子及侧 翼区共发现 11 个序列变异， 其中杂合序列变异共 5 个， 纯合序列变异共 6 个。上述序列变异与疾病表型无 共分离现象。结论
2、排除了 10 个候选基因 （TAOK3、 RAB35、 RPLP0、 PXN、 RNF10、 RHOF、 VPS33A、 RSN、 DENR、 RNP24）为腓骨肌萎缩症 2L 型致病基因的可能。发现了以上 10 个候选基因共 11 个单核苷酸多态， 除镜影 细胞 （reed-steinberg cell， RS） 细胞特异性中间丝相关蛋白基因的 3207GC 在多态数据库已报道， 其余均为 新发现的单核苷酸多态。 【关键词】 腓骨肌萎缩症 2L 型； 候选基因； 基因克隆； 单核苷酸多态性 Cloning to rule out 10 candidate genes located in c
3、hromosome 12q24 for Charcot-Marie-Tooth disease type 2L* ZHANG Ru-xu1， 2，TANG Bei-sha1，ZI Xiao-hong2，LUO Wei3，XIA Kun4，PAN Qian4，HU Zheng-mao4， ZHAO Guo- hua1，GUO Ke2. 1（ Department of Neurology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan， 410008 P . R . China） ； 2 （Department of Neurol
4、ogy，the Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha， Hunan，410013 P . R . China） ； 3 （Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital，Medical College of Zhe- jiang University，Hangzhou，Zhejiang，310003 P . R . China） ； 4 （National Key Laboratory of Medical Genetics，Cen- tral South
5、University，Changsha，Hunan，410078 P . R . China） Corresponding author：TANG Bei-sha，Email：bstang7398yahoo . com . cn 【Abstract】ObjectiveTo clone the disease-causing genes possibly existing in 6.8 cM distance between mi- crosatellite markers D12S1720 and D12S1611 in chromosome 12q24 for Charcot-Marie-T
6、ooth disease type 2L （CMT2L） . MethodsTen positional and functional candidate genes were chosen among all known genes in this locus region by bioinformatics inqury. Mutation detection was performed by sequencing the exons and intron-exon junctions of the candi- date genes. ResultsEleven sequence var
7、iations，that included 5 heterozygous and 6 homozygous variations，were de- tected in the exons and flanking areas of the 10 candidate genes. All the variations showed no co-segregation with disease phenotype. ConclusionTen candidate genes（TAOK3， RAB35， RPLP0， PXN， RNF10， RHOF， VPS33A， RSN， DENR， RNP2
8、4）were ruled out as the disease-causing gene for CMT2L.Ten single nucleotide polymorphisms （SNP）were reported for the first time. 【Key words】 Charcot-Marie-Tooth disease type 2L； candidate genes； gene cloning； single nucleotide poly- morphism *Supported by the National Nature Science Foudation of Ch
9、ina（Proj. No. 30300200） ，and the National 863 Project of China （2004AA227040） 腓骨肌萎缩症 （Charcot-Marie-Tooth disease， CMT） 是一类具 有明显临床和遗传异质性的周围神经病单基因遗传病， 发病率 约为 1/2500， 其遗传方式主要为常染色体显性遗传， 其次为常 染色体隐性遗传及 X 连锁显性或隐性遗传。临床主要表现为 进行性对称性远端肌无力和肌肉萎缩、 腱反射减弱或消失、 轻 到中度远端感觉减退。临床上依据病理和电生理特点可分为 两型： CMT1 型 （脱髓鞘型） 和 CMT2 型
10、 （轴索型） 1， 2。自 1992 年 PMP22基 因 作 为 CMT1A的 致 病 基 因 被 克 隆 以 来 ， 共 有30个 基金 项 目： 国 家 自 然 科 学 基 金 （30300200） ； 国 家 863 计 划 项 目 （2004AA227040） 作者单位： 410008 长沙， 中南大学湘雅医院神经内科 （张如旭、 唐北 沙、 赵国华） ， 湘雅三医院神经内科 （张如旭、 资晓宏、 郭科） ， 中国医学遗 传学国家重点实验室 （夏昆、 潘乾、 胡政茂） ； 浙江医科大学附属二医院 神经内科 （罗巍） 通信作者： 唐北沙， Email：bstang7398 不同的 C
11、MT 遗传位点被定位， 19 个致病基因相继被克隆 3。 Tang 等 4应用全基因组扫描技术及单倍型分析的方法， 将 1 个 常染色体显性遗传的 CMT2 型大家系致病基因定位于 12 号染 色体微卫星标记 D12S1720 和 D12S1611 之间约 6.8 cM 的区间 内， 这是国际上定位的一型新的 CMT 疾病位点， 命名为 CMT2L 并被美国国立生物技术信息中心的人类在线孟德尔遗传网站 收录 （http： / / www. ncbi. nlm. nih. gov/ Omim/ ， OMIM 号 608673） 。 进一步克隆 CMT2L 的致病基因将有助于阐明遗传性周围神经 病
12、的发病机理， 从而为该疾病的预防及治疗奠定基础。 1对象与方法 1.1对象遗传了 7 代的常染色体显性遗传 CMT2L 大家系， 来自中国湖南和湖北两省， 其中可追问到的人数共 165 人， 35 人已死亡。选择家系中 26 名成员作为研究对象，设 100 名家 系外正常人为对照。 981中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 1.2方法 1.2.1候选基因的选择在 UCSC 数据库查询 D12S1720 D12S1611 之间的基因信息， 这个区间总计有已知基因 126 个， Refer
13、ence Genes 88 个。综合分析候选基因的组织表达、 周围神 经结构和生理基础并结合已克隆的周围神经遗传病的致病基 因编码蛋白的结构功能， 筛选了 10 个候选基因进行序列变异 分析， 分别为： TAO 激酶 3（TAOK3/ JIK）基因、 原癌基因家族 RAS 成 员RAB35基 因（RAB35 ）、核 糖 体 蛋 白 P0 基 因 （RPLP0）、 桩蛋白基因（PXN）、 环指蛋白 10 基因（RNF10）、 RAS 原癌基 因 家 族成员 F 基因（RHOF）、 空泡蛋白 转 运 33 基 因 （VPS33A）、 RS 细胞特异性中间丝相关蛋白基因（RSN）、 密度调 节蛋白基
14、因 （DENR） 、 包被囊泡膜蛋白前体 24 基因（RNP24）。 1.2. 2PCR使用 primer3 在线软件 （Http： / / www-genome. wi. mit.edu/ cgi-bin/ primer/ primer3.cgi/ ） 设计引物， 由上海博亚生物 技术有限公司合成。引物参数设定：GC 含量设定在 40% 60%； 退火温度设定在 57 63之间。扩增片段一般设定在 200 bp 500 bp 之间。以完整扩增在周围神经表达的剪接本和 最大剪接本为目标， 合成了扩增 10 个基因外显子及外显子与 内含 子 交 界 的 引物共 111 对。PCR 反应体系为 1
15、0L， 其 中 dNTPs 20mol/ L， 引物各 0.25mol/ L， MgCl21.5 2.0 mmol/ L， gDNA 为 50 ng， Hot Star Taq DNA 聚合酶 0.25 U， 10 缓冲液 1 L， Q-缓冲液 2L。扩增条件： 95 15 min 热起动； 94 30 s， 60 30 s， 72 1 min， 10 个循环； 94 30 s， 56 30 s， 72 1 min， 25 个循环； 72 10 min； 4保存。选取先证者进行 PCR 扩 增。 1.2.3测序和序列分析酶切后的 PCR 产物经 ABI PRISM 377 自动测序仪正反向测序
16、， 测序结果用 DNASTAR 软件中的 Edit- Seq、 SeqMan 程序分析。 1.2.4序列变异的判断发现的杂合序列变异先在 NCBI 和 TSC 的多态数据库 （dbSNP http： / / www. ncbi. nlm. nih. gov/ SNP/ ； TSC http： / / snp.cshl.org/ ） 进行查询排除已知单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP） ， 再进行家系内患者、 家系 内正常人及家系外正常对照的检测观察序列变异与疾病表型 有无共分离现象。 2结果 2.110 个候选基因的生物学信息通过生物信息学查
17、询， 筛 选了 D12S1720 D12S1611 区间的 10 个基因进行基因突变分 析， 10 个候选基因的基因库登录号、 OMIM 登录号、 最大剪接本 的编码区序列 （coding sequence，CDS） 长度、 编码的多肽链长度 和蛋白参与的分子生物学功能， 见表 1。 2.2基因突变分析结果以上 10 个候选基因的 PCR 产物测 序共发现 11 个序列变异， 测序结果见图 1， 其中杂合序列变异 5 个， 分别为 RSN 基因的 3207CG/ C、RPLP0基因的 IVS5-7G T/G、RNF10基因的 IVS13-38GG/ T、 DENR 基因的 IVS2 + 28
18、TA/ T 和 IVS2 + 43AG/ A； 纯合序列变异 6 个， 分别为 PXN 基因的 486AG、 RHOF 基因的 IVS1-1G A、 VPS33A基因的 IVS6 + 23GA、 RSN 基因的 IVS13 + 27TC 和 IVS22 + 97A G、 RNP24基因的 30TC。查询多态数据库， 仅 RSN 基因的 3207 GC （Asp1069Glu） 为已报道的 SNP。家系内其他患者、 家系内 正常人及家系外正常对照的检测表明所有序列变异与疾病表 型无共分离现象。 3讨论 CMT2 （轴索型） 具有遗传异质性， 目前常染色体显性遗传的 CMT2 （ADCMT2） 已
19、经定位了 8 型， 其中 4 型致病基因已被克隆， 分别为驱动蛋白超家族成员 1B 基因 （1p36.2/ kinesin superfamily member 1B gene，KIF1B）突变导致 CMT2A 型 5， RAS 相关 GTP 结合 蛋 白 7 基 因（3q13-q22/ RAS-related GTP-binding protein 7 gene，RAB7）突变导致 CMT2B 型6， 甘氨酰 tRNA 合成酶基因 （7p14/ glycyl tRNA synthetase gene， GARS ）突 变 导 致 CMT2D 型 7、 神经丝轻链基因 （8p21/ neuro
20、filament-light gene，NEFL） 突 变导致 CMT2E 型 8， 其他已定位的 4 型分别为 CMT2C（12q23- q24） 、CMT2G（12q12） 、CMT2F（7q11-q21） 、CMT2L（12q24）4。 常染色体隐性遗传的轴突型 CMT（ARCMT2）已定位 2 型， 其中 1 型致病基因被克隆， 即核纤层蛋白 A/ C 基因 （1q21.2-q21.3/ lamin A/ C gene，LMNA）突 变 导 致 ARCMT2A 型 9。ARCMT2B 定位于 19q13.3， 致病基因尚未克隆。已克隆的致病基因生物 信息学分析表明： 异常的雪旺氏细胞
21、/ 轴索的相互作用、 轴索运 输功能缺陷、 蛋白质合成， 转运及能量供应障碍、 细胞骨架不稳 定及抗凋亡的细胞保护能力下降等可能是导致 CMT 的发病机 理。 在总结 CMT2 已克隆致病基因的生物功能信息基础上， 参 考候 选 基 因 的 组 织 表 达 特 点 和 分 子 生 物 学 功 能， 我 们 在 D12S1720 D12S1611 区间选择 10 个候选基因进行突变分析。 在对上述 10 个候选基因的突变检测中，TAOK3基因和RAB35 基因未发现任何序列变异， 在其余 8 个候选基因共发现 11 个 序列变异， 其中包括杂合序列变异 5 个和纯合序列变异 6 个。 表 1 1
22、0 个基因的生物信息简表 基因基因库登录号OMIM 登录号编码区序列肽链分子生物学功能 TAOK3 （JIK） NM016281-2697898参与 JNK 级联蛋白质氨基酸磷酸化过程 RAB35NM006861604199606201细胞内蛋白质转运； 小 GTP 酶介导的信号转导 RPLP0NM001002180510954317蛋白质的生物合成； 转录延长 PXNNM0028596025051674591信号复合体的形成， 细胞基质黏附， 细胞运动和信号转导 RNF10NM014868-2436811可能参与蛋白质-蛋白质的相互作用 RHOF （ARHF）NM019034 5450963
23、7211肌动蛋白丝的组成； 小 GTP 酶介导的信号转导 VPS33ANM022916650821791596蛋白质运输功能 RSNNM00295617983842841427非选择性囊泡运输和微管相关的生物过程 DENRNM003677604550597198转录起始； 细胞的生长和维持 RNP24NM006815-606201细胞内蛋白运输 091中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 图 1 DNA 测序结果a： RSN 基因 3207CG/ C； b：RPLP0基因 IVS5-7G
24、G/ T； c：RNF10 基因 IVS13-38CA/ C； d： DENR 基因 IVS2 + 28TA/ T； IVS2 + 43AG/ A； e： PXN 基因 486AG； f：RHOF （ARHF）基因 IVS1-1GA； g：VSP33A基因 IVS6 + 23GA； h： RSN 基因 IVS13 + 27TC； i： RSN 基因 IVS22 + 97AG； j：RNP24基因 30TC 在 RSN 基因发现 cDNA 序列第 3207 bp 碱基杂合 GC 置换， 导 致 Asp1069Glu 的氨基酸改变， 该序列变异为正常人群多态， 已 被 NCBI 和 TSC 的多态
25、数据库收录 10。其余 10 个序列变异与 疾病表型无共分离， 在多态数据库查询尚无相关报道， 考虑其 为数据库尚未报道的正常人群多态。 综上所述， 在 10 个候选基因的突变分析中我们没有检测 到与疾病表型共分离的致病突变， 为位置功能候选克隆工作排 除了这 10 个基因是 CMT2L 致病基因的可能。我们共发现 11 个单核苷酸多态， 其中杂合多态共 5 个， 分别为 RSN 基因的 3207CG/ C， 导致 Asp1069Glu 氨基酸替换、RPLP0基因的 IVS5- 7GT/ G、RNF10基因的 IVS13-38GG/ T、 DENR 基因的 IVS2 + 28TA/ T 和 I
26、VS2 + 43AG/ A； 纯合多态共 6 个， 分别为 PXN 基因 的 486AG， 导 致 Ser162Gly 氨 基 酸 替 换、 RHOF 基 因 的 IVS1-1GA、 VPS33A 基因的 IVS6 + 23GA、 RSN 基因的 IVS13 + 27TC 和 IVS22 + 97A G、 RNP24基因的 30TC， 没有改变 亮氨酸的编码， 为同义突变。除 RSN 基因的 3207GC 为 NCBI 和 TSC 的多态数据库已有的 SNP， 其余均为新发现的 SNP。 参考文献 1Dyck PJ，Lambert EH. Lower motor and primary sen
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