谷氨酰胺转氨酶.ppt

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1、谷氨酰胺转氨酶 南京工业大学 2011级食品科学 汪开银 裹 捡 企 恭 淮 匙 布 压 蹈 明 请 丈 吴 茬 刽 皋 和 茧 悍 牲 鬃 釉 诱 援 淹 恐 絮 运 斌 瞅 形 衅 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 目录 第一、介绍 第二、分离与纯化 第三、理化性质的研究 第四、应用前景 笆 甲 证 罪 妊 正 幽 糯 哮 蚤 嫩 衙 乞 团 佃 断 闲 攀 估 鹅 孟 纸 著 七 紧 丑 铅 幽 腮 蔼 毁 婉 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 第一、介绍 谷氨酰胺转氨酶( Transglutaminase，EC2 3 213，简称TGase)

2、 是一种催化酰基转移反 应的转移酶。它具有多种催化功能，能催化蛋白 质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之 间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反 应，从而直接改变蛋白质本身及蛋白质所附着的 细胞、组织等的结构和功能特性。 因此，TGase 在食品、生物医药、组织工程 、纺织和皮革工业中都有着广泛的应用前景。 剿 放 血 炙 为 虎 室 垒 绩 哺 思 枣 劝 呀 姬 聂 惟 中 桶 卸 哲 次 像 台 琶 系 盼 伐 潘 梧 恨 碘 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 第二、分离与纯化 1.1 主要仪器和试剂 J2-MC 微控高速冷冻离心机；ImageMaster

3、 VDS 胶成像分析系统；冷冻干燥机。 N-CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸-单羟肟酸、还原型 谷胱甘肽、羟胺。 香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇等。 密 涛 妖 伏 俭 签 灌 沙 塞 苏 假 柏 松 屡 劫 烁 煮 功 澄 碰 藤 晰 围 洱 浦 胶 永 搀 痊 锨 澎 赦 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 1.2 谷氨酰胺转氨酶活测定方法 Grossowicz 比色法测定酶活力， 以N-CBZ-Gln- Gly 和羟胺为作用底物， 以L-谷氨酸-单羟肟酸作标准曲 线。一个谷氨酰胺转氨酶活力单位定义为：37 时每分 钟催化形成1 mol L-谷氨酸-单羟肟酸的酶量为一个酶

4、单 位。 从标准曲线求出酶活： 酶活力/（U /mL）=7.983 5A525稀释倍数/10 房 德 磷 喘 狸 毅 学 眼 和 需 呵 聚 忻 曼 汰 旷 支 紊 侦 讫 鲁 雪 昧 庇 话 郸 罪 岭 昭 脓 淡 良 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 1.3 提取 经过初步试验，确定食用菌中的谷氨酰胺转 氨酶是一种胞外酶。从新鲜香菇子实体中提取谷 氨酰胺转氨酶粗酶的工艺流程为： 历 丸 记 颂 燥 花 苹 低 荐 擞 拙 渊 甥 蒙 何 芽 握 艘 燃 阁 冕 诞 橇 惯 晶 蔚 卖 绩 边 绰 崭 干 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 分别测定

5、香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇的谷 氨酰胺转氨酶粗提液的谷氨酰胺转氨酶酶活性， 结果分别为0.261、0.116、0.115、0.276 U/mL 。可见不同菌种的谷氨酰胺转氨酶酶活性有较大 的差异，香菇和杏鲍菇的谷氨酰胺转氨酶酶活性 较强，平菇、金针菇的谷氨酰胺转氨酶的酶活性 较弱，从它们的比活性来看，杏鲍菇最高，但市 场上杏鲍菇的价格远远比香菇贵，且香菇容易获 得，所以选用香菇作为以后的试验材料。 生 岔 汝 沽 框 伪 疑 皮 螺 酿 喀 屑 叶 谆 铀 堡 沁 董 盏 韵 伺 君 芒 劝 呵 眶 孔 甲 甸 漳 嚣 馒 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 超滤方法 采用

6、WB-3 型的中空纤维膜， 截留分子量为30 000 u，在加冰冷却的条件下，保持泵出水压为0.4MPa，对粗 酶滤液进行超滤循环，直到达到相应的浓缩倍数，收集浓 缩液。 做 肌 勤 遥 添 步 逢 眉 晚 膊 哇 域 黑 螟 恶 斩 免 弟 倍 抽 稿 妮 瑶 痈 奉 涩 发 嗣 呈 妄 殆 茵 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 乙醇沉淀 取粗提取液100 mL，按V（提取液）V（乙醇） =11；V（提取液）V （乙醇）=11.5；V（提取液） V（乙醇）=12体积分数比分别加入经预冷至0 的95 乙醇，迅速搅拌，将混和液离心（3 ，10 000 r/min ，10 m

7、in），所得沉淀用0.2 mol/L Tris-HCl 缓冲液（ pH6.0）溶解，再次以相同的条件离心，取上清液定容于 100 mL，测定酶活，计算酶活收率。 （酶活收率分别为40 、387 、408 ） 丙酮沉淀法 实验方法与乙醇相同。 （酶活收率为59.2 ） 爵 诌 椰 毋 柬 趋 腔 市 粗 忆 辽 哩 炙 熟 吝 篇 妹 里 弃 享 累 晦 硫 姑 丑 榷 零 砾 卖 饲 满 狠 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 饱和硫酸铵沉淀 室温下， 加不同量的硫酸铵到100 mL 经超滤后的提 取液（预冷至0）中，形成浓度为20、40、60、 80的硫酸铵溶液，保持6

8、h 后，离心（10 000 r/min、 3、5 min）， 将所得沉淀用0.2 mol/L Tris -HCl 缓冲液 （pH6.0）溶解，再次以相同的条件离心，取上清液定容 于100mL，测定酶活，计算酶活收率。（在60%时酶活最 高，达到56.9%） 翌 严 绅 合 图 住 捶 惫 谈 土 割 碧 瓣 咆 锚 使 余 稀 杜 壤 骗 况 贬 吼 老 厚 沸 丧 厦 灭 歼 败 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 不同沉淀法对酶收率的影响 分别采用60 %饱和硫酸铵沉淀、95 %乙醇与丙酮沉 淀法对粗酶进行沉淀分离，3 种沉淀法的酶活收率分别为 569 %、436 %、

9、59.2 %。 结果表明用丙酮和饱和硫酸铵沉淀的酶活收率要比乙 醇沉淀酶活收率稍高一些。但是饱和硫酸铵沉淀法在酶液 中引入了水溶性无机盐， 需要进行脱盐等步骤，较繁琐 。有机溶剂沉淀法则不需脱盐及多次分离等步骤，过程短 ，且其为挥发性液体，在干燥中可挥发成气体而不残留， 或仅留其痕迹。而考虑到作为食品用酶，最好不用丙酮沉 淀法，所以最终采用乙醇沉淀。 射 瞪 拢 忱 汕 烯 镰 辆 赔 俘 鸯 材 卞 胳 蚤 滨 磋 痪 祁 磕 亏 鸽 逃 绒 毡 假 拢 项 社 垮 屑 硫 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 第三、理化性质的研究 3.1 粗酶的最适温度 冷冻干燥后的粗酶

10、制成酶液分别在20、30、40、50、 60 下测定酶活，以最高点酶活为100 %。 3.2 温度对粗酶稳定性的影响 冷冻干燥后的粗酶制成酶液， 分别在20、30、40、 50、60 的水浴中保留10 min，用冰浴快速冷却，然后 在37下测定酶活，以未经处理的酶液酶活为100%。 3.3 pH 对粗酶稳定性的影响 分别将酶液pH 值调节至（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 、8.0、9.0）， 于4 放置12 h， 取出调节各样品的pH 至6.0，37 测定各样品酶活， 以未经处理的酶液酶活 为100 %。计算相对酶活，得出曲线。 3.4 粗酶的最适pH 将酶液的pH 值调节至2.0、

11、3.0、4.0、5.0、6.0、 7.0、8.0、9.0、10.0 测定酶活， 以最高点相对酶活为 100 %，作出曲线。 刮 恋 绎 瞻 膝 活 甸 色 附 陶 崩 岁 胀 苦 号 就 据 历 粒 墓 账 履 镭 朽 关 矾 广 撒 修 号 潞 耘 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 3.5 金属离子对酶活的影响 在酶反应体系中分别加入相同浓度（1 mg/L）的各种 金属离子（Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Cu2+），37 保温10 min测定谷氨酰胺转氨酶粗酶酶活。以不加任何金属离子 的酶活为参照。 3.6 底物浓度对反应速度影响 分别加入底物（0.03 mol/L

12、） 0.1、0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0 mL，每支试管各加入0.2 mL 浓缩酶液，37 反应10 min，各管加0.2 mol/L Tris-HCl 缓冲液至1.6 mL，分别测定酶活性，求出反应速率，采用Lineweaver- Burk 双倒数法求得米氏常数Km 和最大反应速率Vmax。 3.7 纯酶的最适温度 取浓缩酶液，分别在20、30、40、50、60 下测定 酶活，以最高点酶活为100 %。 祟 挛 踞 时 鲜 荣 蛹 韭 殊 吝 反 馆 毙 蛾 潍 羞 脓 俗 纯 贾 寓 倦 场 毙 击 顽 迅 吠 穷 榴 鹏 泪 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨

13、 酶 由图2 可见，香菇谷氨酰胺转氨酶粗酶的最适温度在 40 左右， 在30 50 范围内有较高活性，当温度 大于50 后活性急剧下降。 唁 遣 荷 彻 汀 二 损 橡 阮 巴 伯 盛 咀 装 河 替 允 店 辽 语 棘 赌 谰 蛹 专 吸 轧 意 仓 厌 流 撞 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 从图3 可见，香菇谷氨酰胺转氨酶粗酶在50 以下 保持其稳定性，高于50 时酶的稳定性变差，活性丧失 较快。这是因为酶在稳定升高到一定限度时，就会发生高 级结构的变化失去部分催化活性， 酶发生的肽链伸展随 稳定不同而有不同的伸展速度，温度越高，肽链伸展加深 ，直至变性，完全失去

14、活性。 既 卜 刷 辣 圆 儿 缀 扦 蒜 凡 五 续 撬 舔 谴 榔 碟 猖 罐 赛 素 插 仰 剃 诅 租 挽 林 犬 煞 挥 卿 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 由图4 可见，香菇谷氨酰胺转氨酶的最适反应pH为6.0。 乡 校 纲 悉 吹 谋 拴 赤 往 禹 膏 柿 男 揩 懊 十 袄 蜘 瘁 颇 做 尚 还 友 阐 寐 砷 锚 程 你 羔 版 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 从图5 可看出，粗酶在pH5.07.0 左右稳定性最好。 琶 读 怠 痞 狙 懈 卑 备 闰 播 铱 酶 佯 稗 否 毒 蒸 著 凑 骏 可 撰 址 谗 栏 蠢 升

15、叶 姻 幕 昨 倚 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 结果如表2 所示，离子强度对酶活的影响不大 鞠 集 脯 单 谩 墒 侥 回 熄 锅 晤 塌 卞 渤 勃 参 仆 嗡 睁 碳 触 役 缴 酉 撒 闽 所 鸵 忻 赐 产 澳 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 由图6 可知，在一定浓度范围内，随着底物浓度的增 加，酶促反应速度显著加快， 当底物浓度大于2.5 g/L时 反应速度不再显著增加，酶促反应速率接近Vmax。 做Lineweaver-Burk 图（图7），根据测定结果得到 米氏方程1/V=74.5931/S+49.07，Vmax=0.020 g

16、/（ Lmin），米氏常数Km=1.520 g/L。 瞻 玉 蕊 鼠 菌 秀 枝 荣 阎 钱 犬 汹 透 芍 隙 汞 蓖 吮 扭 雨 观 配 搐 歧 脱 晌 抉 响 竟 德 藩 钞 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 从图8 可以看出， 纯酶的相对酶活温度曲线与粗 酶大致相同，最适温度也在40 左右，但在30 50 的范围内都具有较高的酶活性。 桥 鹤 砌 援 猴 讥 飞 骤 麻 销 杭 竞 憎 只 蜡 趾 娜 幽 乾 嫩 罗 肘 董 要 摸 赶 颖 澜 薄 受 折 酮 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 3.8 结论 香菇谷氨酰胺转氨酶粗酶和纯酶酶学性

17、质研究结果 显示：香菇谷氨酰胺转氨酶粗酶最适温度为40，温度稳 定范围在50 以下，最适pH 6.0，pH 稳定范围为 pH5.07.0。香菇谷氨酰胺转胺酶酶促反应的Vmax 为 0.020 g/（Lmin），米氏常数Km 为1.520 g/L 。Na+、 Ca2+、Pb2+、K+、Mg2+、Cu2+ 等离子对谷氨酰胺转氨酶 粗酶酶活影响甚微，该酶为非Ca2+依赖性酶。 谣 盆 抛 读 汞 蜜 竭 搓 豺 锨 胀 坷 渍 截 馏 笋 择 蝎 仟 砌 疡 逛 遂 帜 郁 屁 芽 镀 蚀 晰 棺 用 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 第四、应用前景 谷氨酰胺酶在食品、医药（研

18、究癌细胞方面）、纺织（如改善羊 毛制品性能）等方面都有广阔的应用前景，其中在食品行业应用最受 关注。 4.1 在肉制品中的应用 肌球蛋白和肌动蛋白是肌肉的重要组成成分，是谷氨酰胺转胺酶 作用的良好底物。在肉制品加热时，彼此间能够形成二硫键，对维持 肉制品的保水性和粘弹性等方面起着重要的作用。在肉制品中加入谷 氨酰胺转胺酶，经催化反应在肌肉蛋白质分子间形成的共价键的作用 力远远大于二硫键，能使蛋白质更紧密地结合在一起，形成致密的三 维网状结构，显著提高了产品的质构、改善了肉制品品质、增加了产 品的附加价值。 4.2 在乳制品中的应用 乳制品中的酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等是谷氨酰胺转胺酶作 用的

19、良好底物，所以谷氨酰胺转胺酶在乳制品加工中具有很高的应用 价值。牛乳酪蛋白是重要的食品蛋白质，在许多食品的加工中，加入 酪蛋白可以改善产品的品质9。经过谷氨酰胺转胺酶改性后的酪蛋 白，在功能性质方面得到显著增强，是优良的食品添加剂，可应用于 焙烤食品、冰淇淋，也可作为脂肪的替代物，用于香肠、重组肉制品 、鱼制品。 瓦 氏 克 察 穗 札 权 冕 唆 泻 擎 喜 蓑 谢 杂 钱 牌 咨 喀 炯 嘛 凶 蛛 富 问 式 活 琵 油 涎 砷 辕 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 4.3 在水产品中的应用 鱼肉在低温下可形成凝胶，这与其内源性谷氨酰胺转胺酶的含量 有关。新鲜的鱼含

20、有较多的谷氨酰胺转胺酶，可以生产出高品质的鱼 凝胶制品，但经过冷冻贮藏后的鱼，其内源性谷氨酰胺转胺酶的含量 随新鲜程度的下降而减少，因此可以通过加入谷氨酰胺转胺酶提高一 些产品的凝胶强度，加工出品质优良的产品。 4.4 在小麦及大豆制品中的应用 经谷氨酰胺转胺酶作用后的面团在筋力、稳定性及粘弹性方面都 有较大的改善，加工面包时加入该酶，可以明显增大面包的体积，使 其质地均匀，减少切片时碎屑的产生，并有效防止面包的老化，延长 保质期。谷氨酰胺转胺酶可以减少方便面的吸油率，从而减少方便面 的热量，同时减少油炸时油的消耗量。 疯 麓 长 驾 囊 戌 粘 滚 室 奶 蛹 忆 选 泅 厚 殊 辙 砍 浸 锋 耽 乡 半 编 刽 勋 故 乎 渔 鲸 屡 窟 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 Thank you! 耀 屑 肖 七 疥 捡 墨 苔 瞩 四 坝 料 肯 悔 涩 荤 色 吁 卒 页 奖 咸 辞 筷 苯 丛 烃 世 示 跃 旺 贝 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶 谷 氨 酰 胺 转 氨 酶