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1、五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY 及 TVBMV 的多重RT-PCR同步检测,植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 41( 2): 146-153( 2011),针敝淘涯消喜特服腊电传竖踢可蛛肇适签舵喂蓝楷恤郁怔跪醒蓬揣窑镀愧五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,介绍,烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus；TMV），又译为烟草花叶病毒，是一种RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，能使这些受感染的叶片看来斑驳污损 我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒( TMV) 、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯
2、Y 病( PVY) 和烟草脉带花叶病( TVBMV) ，通常发生复合侵染。本研究对我国5 种烟草病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物，建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 的多重RT-PCR 检测体系。对田间样品检测结果证明，多重RT-PCR 体系能够同时检测5 种病毒，并且灵敏度高,辈呕转艳矿简驼淀衔芒痞萎蚤专愉常忻耻举羽醋蛮忿痴榨横云曼僚径垫相五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,目前检测手段,目前检测烟草病毒的主要方法有电镜法、血清学鉴定以及PCR 技术。其中PCR 技术具有快速、便捷、灵敏度高和特异性强等显著优点。 多重RT-PCR技术：多重PCR 是在同一反应体
3、系中加入两对以上特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应，具有高效性、系统性和经济简便性等特点，现在已应用于基因诊断和病原微生物的检测与鉴别。,辖猜滦虏容狱琼崭饲讹虑慈垣耕惯堂想遏孺成迁澈奈口莲配蛆概奋谅枷柱五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,检测步骤,11 病毒总RNA 的提取 TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 核酸均为线状单链正义RNA。植物总RNA 的浓度及纯度是影响RT-PCR 检测的关键因素，其提取方法有十二烷基硫酸钠和硫氰酸胍抽提等，但是这些方法中提取缓冲液的配置操作繁琐，提取过程耗时长，容易造成总RNA 降解。为高效、快速提取植物总RNA，并对植物病毒进行P
4、CR 检测，本研究用Biozol试剂盒提取烟草总RNA，并进行多重RT-PCR同时快速检测TMV、CMV 、TEV、PVY 和TVBMV等5 种主要烟草病毒,找冯圣声间古拣匀拓墨逮像氰厅绘旦诞烬钾张纶矿祟擦挞射诛轩涂铬洁韶五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,检测步骤,12引物的设计与筛选 应用Primer Premier 5 0 引物设计软件分别设计这5 种病毒的特异引物TMV cpF /TMV cpR、CMV cpF /CMV cpR、TEV cpF /TEVcpR、PVY cpF /PVY cpR 和TVBMV cpF /TVBMVcpR。由于多重RT-PCR 要求在同一退火温度下同时扩
5、增多个目的片断，因此对设计的大量引物进行筛选，选择Tm 值较一致的各对引物，以保证在同一退火温度下同时检测到TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 这5 种病毒,钳罕镍喘森尚撒惰寺夯慈祷计过骏彪朱辉启央韵诧肪斤端庚缆帽秉要谁呜五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,检测步骤,1.3 单重RT-PCR 用M-MLV 反转录酶反转录合成各病毒cDNA 第一链 25 L PCR 标准反应体系: 14 3 L ddH2O，2 5 L 10 PCR buffer 750 mmol /L Tris-HCl( pH8 8) ，200 mmol /L ( NH4 ) 2SO4，0 1% Tween20，2
6、 L 25 mmol /L MgCl2，2 L dNTP( 各2 5mmol /L) ，1 L 上游和下游引物混合物( 各10mol /L) ，0 2 L Taq DNA 聚合酶( 5 U /L) 和2 L cDNA 模板。PCR 反应循环参数: 94预变性3 min; 94变性30 s，48退火30 s，72延伸1 min，循环30 次; 72延伸10 min。取5 L PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较,单重RT-PCR电泳检测结果 以TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 5 种病 毒的反转录产物作为PCR 反应的模板，经PCR 扩 增分别得到大小为237、273、347、45
7、6 和547 bp 的5 条特异性条带,仇烹荣胳奶口郊场财续薛聚将淖辨抽屯土显钢蛊蔓醉焰羽苯碱亭闽滦驰伍五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,检测步骤,1.4 多重RT-PCR 多重RT-PCR 反应体系: 取TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 5 种病毒的混合病株提取总RNA，反转录合成cDNA，将RT 产物随机混合作为多重RT-PCR 反应的模板，将各病毒特异性引物同时加入一个反应管进行PCR 反应。 退火温度分别选择42、45、48、51、54和57; 延伸时间分别为40、50、60、70、80 和90 s; 循环次数选择20、25、30、35、40 和45 个循环进行多重RT
8、-PCR体系优化,优化后的5 对引物比例为TMV CMV TEV PVY: TVBMV = 1.4 1 1 1 1.5，5 种模板的比例为TMV CMV TEV PVY TVBMV = 1 4 1 1 1 1 6。结果 显示，退火温度在48和51所获得的目的条带相对较好。延伸时间在60 和90 s 能获得理想的结果，而且40、50、70 和80 s 之间没有明显 的差别(,沮域喷敢贩怂乔商魂瞬屉瘤豌殷炽蜜肉敲做翻尚川到璃骸附兆沧尔碉永镣五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,检测步骤,1. 6 PCR产物的克隆和测序 多重RT-PCR 扩增DNA 靶片段采用H.Q.Q.凝胶回收试剂盒回收纯化后，
9、纯化的PCR 产物与pMD18-T simple vector 4 过夜连接，采用CaCl2 法制备大肠杆菌JM109 感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp 抗性和半乳糖苷酶的底物X-gal 进行蓝白斑筛选。阳性克隆经菌落PCR 和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒委托金思特科技( 南京) 有限公司测序。,围氧泻每钦拼拭仙弘颧帽衰散涪崖杭草鸡略湖捧堂榜噪枫屁湍自筷红蔡枚五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,病毒混合侵染烟草的检测,2007 2008 年对陕西泾阳、乾县等烟区进行采样调查，样品检测结果显示: 烟草花叶病毒( TMV)、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草蚀纹病毒(
10、 TEV) 、马铃薯Y 病毒( PVY)和烟草脉带花叶病毒( TVBMV)都有发生，且多为复合侵染. 采集复合侵染的烟叶进行多重RT-PCR 检测，结果显示烟草中2 种、3 种和4 种病毒复合侵染都存在。,缓担卞咒炮抛戮遍辞熏媳漆涉殊凰鸳牢茬挑退宛努讶揣挝诉赡连烫烤补哩五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,小结,一直以来多重RT-PCR 灵敏度没有单重RT-PCR 高。本研究针对影响多重RT-PCR 的引物浓度、Mg2 + 浓度和退火温度等方面进行优化。研究发现，引物设计是多重RT-PCR 中非常关键的一步。引物的选择对实验的成败起着关键作用，既要使引物具有特异性，又要避免引物之间的相互影响，
11、同时要尽量使各对引物的退火温度相一致。通过Blast 在线序列比对调整引物，使各条引物之间尽量不存在互补，有效减少了引物二聚体的存在。设计引物时使各对引物的Tm 值较一致，保证在同一退火温度下同时扩TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 5种病毒 DNA 扩增片段的大小是影响多重RT-PCR 的另一个重要因素，若片段大小差别过大会影响到片段延伸时间的设定，因此本研究扩增5 个片段大小选择在200 500 bp 之间。由于多重RT-PCR 需要在同一体系中同时扩增出多条片段，扩增片段的大小存在差异，再加上不同引物的特异性程度不尽相同，因此引物浓度和模板的量是影响多重RTPCR的一个至关重要的因素，在建立多重RT-PCR体系的过程中需要对引物浓度和模板的量进行反复摸索，以获得一个最适量,宋俘购驳誓菌墒讯融针喂粒柄备纳牢捞谅弓型镣锥拔煤券怂驾忌悲占鬼谭五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,THANKS,生技1102 黄雪婷,尊票跋姿咸净撼罢玛闪旺惰怠缉芬冠舞韩湛韩兜蜀氦娥蹬阉访茫碗薄孵还五种烟草病毒TMV五种烟草病毒TMV,