分光光度法课件.ppt

1、第六章第六章紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法(UV-visSpectrophotometry)内容提要第一节第一节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一、透光率和吸光度一、透光率和吸光度二、物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱三、三、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律第二节第二节 可见分光光度法可见分光光度法第三节第三节 提高测量灵敏度和准确度的方法提高测量灵敏度和准确度的方法 一、分光光度法的误差一、分光光度法的误差 二、提高测量灵敏度和准确度的方法二、提高测量灵敏度和准确度的方法基本要求n掌握掌握Lambert-BerrLambert-Berr定律以及透光率、吸定

2、律以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数等基本概念及相互光度、摩尔吸光系数等基本概念及相互关系。关系。n熟悉可见分光光度法的测定方法熟悉可见分光光度法的测定方法标准标准曲线法。曲线法。n了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱的意义。的意义。n了解提高测量灵敏度和准确度的方法。了解提高测量灵敏度和准确度的方法。第一节第一节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一、透光率和吸光度一、透光率和吸光度二、物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱三、三、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律分光光度法分光光度法根据根据物质的物质的吸收光谱吸收光谱及光的及光的 吸收定律吸

3、收定律，对物质进行，对物质进行定性定性、定定量量分析的一种方法。分析的一种方法。分光光度法特点分光光度法特点n灵敏度高灵敏度高检测限检测限10-510-6mol.L-1适适于于微量组分微量组分测定测定n准确度高准确度高相对误差相对误差25%n操作简便，测定快速。显色操作简便，测定快速。显色-测定测定n应用广泛应用广泛第一节第一节分光光度法分光光度法基本原理基本原理入射光入射光I0吸收吸收Ia透射透射ItI0=Ia+It+Ir I0=Ia+It一一、透光率透光率(T)T)和吸光度和吸光度(A)A)第一节第一节分光光度法分光光度法基本原理基本原理透光率透光率(transmittance)T=It/

4、I0吸光度吸光度(absorbance)一一、透光率透光率(T)T)和吸光度和吸光度(A)A)T=10-A第一节第一节分光光度法分光光度法基本原理基本原理 物质对光的吸收具有选择性，只有当物质对光的吸收具有选择性，只有当光子的能量光子的能量(h(h )与被照射物质粒子与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差的基态和激发态能量之差(E)(E)相等相等时才能被吸收。时才能被吸收。M(基态)+h M*(激发态)物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收 WhyAbsorptionOccurs?Energylevel:E0E1E1E1GroundlevelelectronicExcitedlevelmol

5、ecularvibrationmolecularrotationUV/Visinfrared互补（色）光互补（色）光complementarycolors第一节第一节分光光度法分光光度法基本原理基本原理 若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补色则溶液呈吸收光的互补色。用不同波长的单色光依次用不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色通过某一固定浓度的有色溶液，分别测定其对不同溶液，分别测定其对不同波长的吸光度，以波长波长的吸光度，以波长 为横坐标，吸光度为横坐标，吸光度A为纵为纵坐标作图，即为坐标作图，即为吸收光谱吸收光谱(absorption

6、spectrum)，或称或称吸收曲线吸收曲线。(邻二氮菲邻二氮菲)合铁合铁(II)的吸收光谱的吸收光谱二物质的吸收光谱二物质的吸收光谱max max 峰形曲线，具有最大吸收波长峰形曲线，具有最大吸收波长maxmax。在此。在此波长下，溶液吸光度最大。波长下，溶液吸光度最大。浓度越大，吸收峰越高浓度越大，吸收峰越高(A(A越大越大)。同一物质不同浓度的溶液，吸收光谱基本同一物质不同浓度的溶液，吸收光谱基本形状相同。最大吸收波长形状相同。最大吸收波长maxmax位置不变。位置不变。吸收光谱的特点吸收光谱的特点:同一物质的同种溶液同一物质的同种溶液maxmax不随物质的浓度不随物质的浓度而变。而变。

7、maxmax与溶剂有关。与溶剂有关。不同物质不同物质,maxmax不同不同,maxmax是定性分析的是定性分析的依据（与吸光系数结合）。依据（与吸光系数结合）。定量定量分析时，用分析时，用maxmax的单色光作入射光，的单色光作入射光，灵敏度最高。灵敏度最高。maxmax重要参数重要参数 当入射光当入射光波长波长、强度强度、溶剂溶剂、吸光吸光物质物质的种类和溶液的种类和溶液温度温度一定时，一定时，A与与液液层厚度层厚度b和溶液和溶液浓度浓度c 有关：有关：c 一定一定,Ab Lambertb 一定一定,Ac Beer A=bc三、三、LambertBeer 定律定律三、Lambert-Beer

8、定律n A=bc 溶液厚度溶液厚度b,单位单位:cm 浓度浓度c，单位，单位mol L-1 摩尔吸光系数摩尔吸光系数，单位，单位L mol-1 cm-1n若用质量浓度若用质量浓度 代替代替cA=ab 质量浓度质量浓度 ,单位单位:g L-1 质量吸光系数质量吸光系数a,单位单位:L g-1 cm-1吸光系数吸光系数 n与入射光的波长、物质的性质、溶与入射光的波长、物质的性质、溶剂和温度有关；与浓度无关；剂和温度有关；与浓度无关；n 103，可用于定量测定；，可用于定量测定；n与与maxmax一起可以作为定性的依据。一起可以作为定性的依据。A=bc A ab=aMT=10-bcLambertbe

9、er定律定律适用条件适用条件Preconditions:nParallel&MonochromaticincidentlightnHomogeneousmedianNoemission,scatteringorphoto-chemicalreactionsnlowconcentration(c0.001molL-1)A1=e1bc1A2=e2bc2A=A1+A2=e1bc1+e2bc2吸光度的加合性吸光度的加合性AdditionofA 例：测试酶与腺苷酸例：测试酶与腺苷酸(AMP)混合体系的吸光度混合体系的吸光度如下如下A(280nm)=0.46，A(260nm)=0.58，试试计算每一组分的

10、浓度。计算每一组分的浓度。已知：酶的已知：酶的(280nm)=2.96 104L mol-1 cm-1(260nm)=1.52 104L mol-1 cm-1AMP的的(280nm)=2.4 103L mol-1 cm-1(260nm)=1.5 104L mol-1 cm-1吸收池厚度为吸收池厚度为1.00cm。A1=1bc1A2=2bc2A=A1+A2=1bc1+2bc2A(280nm)=0.46=(280nm)bcA(260nm)=0.58=(260nm)bc第三节第三节可见分光光度法可见分光光度法 1.1.标准曲线法标准曲线法 n配制系列浓度标准溶液；配制系列浓度标准溶液；n测定系列标准

11、溶液吸光度测定系列标准溶液吸光度A A，作吸，作吸光度光度A A对溶液浓度对溶液浓度c c的图，得过坐标的图，得过坐标原点的直线原点的直线-标准曲线标准曲线；n在相同条件下，测量被测溶液的吸在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液浓度。光度，在标准曲线上查得溶液浓度。2.标准对照法标准对照法先先配配制制一一个个与与被被测测溶溶液液浓浓度度相相近近的的标标准准溶溶液液(其其浓浓度度用用cs表表示示)，在在 max处处测测出出吸吸光光度度As，在在相相同同条条件件下下测测出出试试样样溶溶液液的的吸吸光光度度Ax，则则 试试 样样 溶溶 液液 浓浓 度度 cs可可 按按 下下 式式

12、求求 得得：Ax/As=cx/cs cx=cs Ax/AsI 参比溶液的作用：扣除一切不来源于参比溶液的作用：扣除一切不来源于 目标产物目标产物的光吸收。的光吸收。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。常用参比溶液：常用参比溶液：溶剂空白溶剂空白试剂空白试剂空白 试样空白试样空白 参比参比（空白）（空白）溶液溶液 blank常用参比溶液常用参比溶液成份成份溶剂溶剂显色剂显色剂试试样样其他其他适用范围适用范围溶剂空白溶剂空白显色剂、试显色剂、试样均无吸收样均无吸收试剂空白试剂空白试样无吸收试样无吸收显色剂有吸显色剂有吸收收试样空白试样空白显色剂无吸显

13、色剂无吸收，试样有收，试样有吸收吸收第四节第四节提高测量灵敏度和准确度的方法提高测量灵敏度和准确度的方法自学自学重点看：重点看：分光光度法的误差来源分光光度法的误差来源显色剂的选择显色剂的选择测定条件的选择测定条件的选择本章小结本章小结n基本概念：吸光度，透光率，吸光系数，基本概念：吸光度，透光率，吸光系数，最大吸收波长，显色剂，参比溶液吸收最大吸收波长，显色剂，参比溶液吸收曲线，标准曲线曲线，标准曲线n基本计算：基本计算：A=bcn测定方法：标准曲线法测定方法：标准曲线法标准对照法标准对照法 判断题判断题1.分分光光光光度度法法灵灵敏敏度度高高，特特别别适适用用于于常常量量组分的测定。组分的

14、测定。（）2.光光照照射射有有色色溶溶液液时时，A与与T的的关关系系为为lgT=A。（）3.当当某某一一波波长长的的单单色色光光照照射射某某溶溶液液时时，若若T=100%，说说明明该该溶溶液液对对此此波波长长的的光光无无吸吸收。收。（）4.符符合合Lambert-Beer定定律律的的某某有有色色溶溶液液，其其他他条条件件一一定定，浓浓度度越越大大，吸吸光度越大。（光度越大。（）5.如如果果吸吸收收池池的的厚厚度度增增加加1倍倍，则则溶溶液液的透光率将减少的透光率将减少1倍。倍。（）6.吸吸光光系系数数与与入入射射光光波波长长、溶溶剂剂及及溶溶液浓度有关。液浓度有关。（）7.愈愈大大，表表明明溶

15、溶液液对对入入射射光光愈愈易易吸吸收收，测定的灵敏度愈高。测定的灵敏度愈高。（）8.一一般般 值值在在103以以上上即即可可进进行行分分光光光光度法测定。度法测定。（）9.吸吸收收曲曲线线的的基基本本形形状状与与溶溶液液浓浓度度无无关。关。（）二、选择题二、选择题1关于关于Lambert-Beer定律，下述正确的是定律，下述正确的是A.该定律仅适用于可见光区的单色光。该定律仅适用于可见光区的单色光。B.该定律仅适用于有色物质的含量测定。该定律仅适用于有色物质的含量测定。C.其他条件不变，溶液浓度改变，吸光度其他条件不变，溶液浓度改变，吸光度和吸光系数都会改变。和吸光系数都会改变。D.其他条件不

16、变，入射光波长改变，吸光其他条件不变，入射光波长改变，吸光度和吸光系数都会改变。度和吸光系数都会改变。2在分光光度法中吸光度在分光光度法中吸光度A可表示为可表示为A.It/I0B.1/TC.lgT D.lg(I0/It)3下列各式哪些不符合下列各式哪些不符合L-B定律定律A.T=10 bcB.1/T=10 bcC.T=-lgAD.lg(1/T)=bc4在可见分光光度法中，影响吸光系数在可见分光光度法中，影响吸光系数的因素是的因素是（）A.入射光波长入射光波长B.溶液浓度溶液浓度C.溶液厚度溶液厚度D.入射光强度入射光强度5下面说法正确的是下面说法正确的是A.吸收光谱的基本形状与溶液的浓度无关吸

17、收光谱的基本形状与溶液的浓度无关B.吸收光谱与物质的特性无关吸收光谱与物质的特性无关C.浓度愈大，吸光系数愈大浓度愈大，吸光系数愈大D.其其他他因因素素一一定定时时，吸吸光光度度值值与与测测定定波波长长成正比成正比E.波波长长一一定定时时，测测定定不不同同浓浓度度溶溶液液的的A值值可绘制吸收光谱曲线可绘制吸收光谱曲线6符符合合Beer定定律律的的某某有有色色物物质质溶溶液液，当当其其浓浓度度改改变变时时，其其吸吸收收光光谱谱曲曲线线上上的的最最大大吸吸收收峰的位置将峰的位置将（）A.向短波方向移动向短波方向移动B.向长波方向移动向长波方向移动C.不改变，但峰高度改变不改变，但峰高度改变D.不改

18、变，峰高度也不变不改变，峰高度也不变E.改变，但峰高度不变改变，但峰高度不变7分分光光光光度度法法中中使使用用试试剂剂空空白白作作对对照照的的目目的的是：是：A.用以消除仪器测量误差用以消除仪器测量误差B.用以消除溶液偏离用以消除溶液偏离Beer定律引起的误差定律引起的误差C.用以消除单色光纯度差引起的误差用以消除单色光纯度差引起的误差D.用用以以消消除除溶溶剂剂、显显色色剂剂等等物物质质对对入入射射光光的吸收的吸收8下面有关显色剂的叙述正确的是下面有关显色剂的叙述正确的是（）A.能与被测物质生成稳定的有色物质能与被测物质生成稳定的有色物质B.必须是本身有色的物质必须是本身有色的物质C.必须是本身无色的物质必须是本身无色的物质D.与被测物质的颜色互补与被测物质的颜色互补E.在测定波长处，应有明显吸收在测定波长处，应有明显吸收