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1、锦鲫Clock基因表达量分析中的内参基因稳定性比较 摘 要 为研究锦鲫Clock基因表达量分析中的内参基因稳定性，采用qRTPCR技术进行实时荧光定量分析，并用Ge Norm 和 Norm Finder软件对5个内参基因（RPL13，GAPDH，18 S rRNA，actin和RPS29）进行稳定性评估，筛选出不同组织中最适合的内参基因，以准确定量Clock 基因的相对表达水平.实验结果表明，5个内参基因中，18 S rRNA在锦鲫的肌肉、心脏、肝脏中表达最稳定，actin在肠中表达最稳定，RPL13在肾中表达最稳定；根据筛选的内参基因定量Clock基因的相对表达水平发现，Clock基因在锦鲫
2、肌肉中相对表达量最高，其次依次是肝脏、肾、肠，心脏中最低.本研究准确定量 Clock基因， 为锦鲫生物钟节律机制的下一步研究奠定了理论基础. 关键词 内参基因；qRTPCR；锦鲫；Ge Norm程序；Norm Finder程序 中图分类号 S9174文献标识码 A文章编号 10002537（2016）06003706 Stability Comparison of Reference Genes on Expression Analysis of Clock Gene in Carassius Auratus PENG Zhitao1，2， JIANG Guomin3， ZOU Li3， LI
3、 Jinlong3， CHENG Xiaofei3， FANG Lijuan4， WANG Xiaoqing1*， LIU Li1，3* （1. College of Animal Science and Technology， Hunan Agriculture University， Changsha 410128， China； 2. Aquatic Products Seed Stock Station in Hunan Province， Changsha 410153， China； 3. Fisheries Research Institute of Hunan Province
4、， Changsha 410153， China； 4. College of Basic Medicine， Central South University， Changsha 410012， China） Abstract The aim of this study is to compare the stability difference of reference genes from the expression analysis of Clock gene in Carassius auratus. The mRNA expression of five candidate re
5、ference genes such as RPL13， GAPDH 18 S rRNA， actin， and RPS29 were detected by using the qRTPCR method， and Ge Norm and Norm Finder software packages. The optimal reference genes selected by analyzing and evaluating their mRNA expression stability were applied to accurately quantify the relative ex
6、pression level of the Clock gene in different tissues of Carassius auratus. Our results show that one of the most stable reference genes was 18 S rRNA from three tissues， including muscle， heart， and liver， among the five reference genes， whereas that found in intestines was actin and in kidney was
7、RPL13. When these optimal reference genes were selected in five tissues， we found that the relative expression level of the Clock gene was the highest in the muscle tissue， followed by liver， kidney， and intestines， and the lowest was in heart. In summary， this study has accurately quantified the re
8、lative expression levels of the Clock gene in tissues， which should serve as the theoretical basis for the future investigation of the Clock gene rhythm system. Key words reference gene； qRTPCR； Carassius auratus； Ge Norm software； Norm Finder software 实时荧光定量PCR（qRTPCR）技术因具有灵敏度高、重复性好以及定量准确等优点，被广泛用于生
9、物科学的各个研究领域.但这一技术能否准确定量取决于很多因素，如实验材料质量、RNA质量、cDNA第一链合成效率及内参基因的选择1.其中，选择合适的内参基因对试验数据进行校正和标准化，获得更接近于目的基因特异性表达的真实值是基因表达定量实验中的关键2.内参基因，也叫看家（持家）基因，是用来做内部参照的基因， 因具有在各个组织和细胞中表达相对恒定的特点而作为目的基因的相对表达水平时的参照基因.一个理想的内参基因要在不同组织、不同发育阶段以及不同处理因素下都能体现恒定的表达水平.然而，现实中稳定表达的基因几乎不存在，因此选择合适的内参基因用于基因表达差异分析非常关键.Clock基因是一种生物钟基因，
10、在动物的各个组织中广泛表达3，在维持正常的近日节律中起着至关重要的作用.本研究选择RPL13，GAPDH，18 S rRNA，actin和RPS29共 5个候选内参基因，采用 SYBR greenqRTPCR方法，利用Ge Norm程序和Norm Finder程序研究鲫Clock基因表达量分析中这5个内参基因的稳定性. 1 材料与方法 1.1 实验样品 样品采集于湖南省水产科学研究所原种中心，取平均体重为（505） g的健康锦鲫中不同组织，包括肌肉、肝脏、心脏、肠、肾共5个.采样前将锦鲫用 MS222（80 mg/L）麻醉4，取样时在放置有冰袋的解剖盘上进行， 样品采集后迅速置于液氮中保存，再
11、转存于-80 冰箱储藏备用. 1.2 总 RNA提取和 c DNA合成 分别取100 mg 冻存组织样品，按照 Trizol试剂法（Invitrogen公司， 美国）提取总 RNA，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳对28 S 和18 S rRNA的完整性进行鉴定，并用紫外分光光度计测定OD260/OD280的值，以检测总RNA的纯度和浓度.按照Prime Script TM reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）反转录试剂盒操作流程（TaKaRa公司，日本），取2 g总RNA合成cDNA第一链.置于-20 备用. 1.3 Clock基因及内参
12、基因的引物设计 选择不同功能的5个常用内参基因，即RPL13（核糖体蛋白基因L13），GAPDH（3磷酸甘油醛脱氢酶），18 S rRNA（18 S核糖体RNA），actin（肌动蛋白基因）和RPS29（核糖体蛋白S29基因）进行研究.根据 NCBI 中已公布的锦鲫及与其同源性较高的序列，用 Primer premier 5.0软件设计特异性引物（表1），并验证引物二聚体、发卡结构等，引物合成和扩增产物的基因序列测定由上海生工公司完成. 1.4 Clock基因及内参基因qRTPCR分析 qRTPCR反应在CFX96TM RealTime System（BIORAD公司，美国）中进行.参照SYB
13、R Premix Ex Taq II（ Tli RNaseH Plus）试剂盒说明书，准备反应体系为荧光染料SYBR Premix 12.5 L，cDNA 模板2.0 L， Forward primer 1.0 L，Reverse primer 1.0 L，加无菌水补至总体积25 L.反应条件为： 95 预变性60 s，95 变性5 s， 65 退火、延伸30 s， 40个循环绘制溶解曲线：6595 ，每0.1 s读板一次. 1.5 数据分析 实时荧光定量PCR结束后，实验数据用Excel软件进行初步处理，采用2CT法进行计算5，即在Excel 中设定不同样本中某一看家基因CT值最小者的表达量
14、为1，其他样本与此看家基因的相对表达量则为 2-CT，将这些数据导入Ge Norm程序（http：medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/）计算内参基因表达稳定度的平均值M（M值越小，表达越稳定），并通过看家基因标准化因子的配对差异分析（Vn/（n+1）来判定内参基因的最适数目6.另外，应用 Andersen 编写的程序 Norm Finder算出表明稳定程度的S值（S值越小，表达越稳定），选出稳定的内参基因与Ge Norm程序分析结果进行综合比较，从而优选出最佳内参基因6.公式为目的基因的表达量=2-CT7，其中CT=（CT目的基因-CT内参基因）实验组-（CT目的基
15、因-CT内参基因）对照组.采用SPSS 16.0软件对所得数据进行单因素方差分析（One Way ANOVA），采用最小显著差数法（LSD）进行多重比较，P 图4 肌肉（A），心脏（B），肝脏（C），肠（D），肾（E）中内参基因的稳定性比较（Ge Norm 分析和 Norm Finder分析） Fig.4 Expression stability of reference genes in different tissues by Ge Norm and Norm Finder （A， Muscle； B， Heart； C， Liver； D，Intestine； E，Kidney） 通过N
16、orm Finder 软件分析得出，S值从大到小（基因稳定性从最不稳定到最稳定）依次为：肌肉中，actin，GAPDH，RPS29，RPL13，18 S rRNA；心脏中，actin，RPS29，GAPDH，RPL13，18 S rRNA；肝脏中，GAPDH，actin， RPS29，RPL13，18 S rRNA；肠中，RPS29，18 S rRNA，GAPDH，RPL13，actin；肾中，RPS29，18 S rRNA，actin，GAPDH，RPL13. Ge Norm软件分析的结果得出最适合的内参基因数，而Norm Finder 软件分析能选出稳定性最高的内参基因.因此，综合比较 2
17、 种软件的评价结果，筛选出肌肉、心脏、肝脏中最佳内参基因均为18 S rRNA，而肠中最佳内参基因为actin，肾中的为RPL13. 2.4 Clock基因的表达水平 图5 锦鲫Clock基因相对表达水平 Fig.5 Relative expression levels of Clock genes in Carassius auratus 根据锦鲫内参基因的稳定性评价结果，肌肉、心脏、肝脏以18 S rRNA作为内参基因，肠以actin和肾以RPL13作为内参基因，采用qRTPCR方法进行定量，检测锦鲫不同组织中Clock基因表达量.图5结果表明，Clock基因在肌肉中相对表达量最高，其次依
18、次是肝脏、肾、肠，心脏中最低（P 2 SUZUKI T， HIGGINS P J， CRAWFORD D R. Control selection for RNA quantitationJ. Biotechniques， 2000，29（2）：332337. 3 KARAGANIS S P， BARTELL P A， SHENDE V R， et al. Modulation of metabolic and clock gene mRNA rhythms by pineal and retinal circadian oscillatorsJ. Gener Comp Endocrinol，
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