1、端端粒长度及端粒酶粒长度及端粒酶活性与石斛年龄关系活性与石斛年龄关系的研究的研究报告人：吴劲松报告人：吴劲松指导老师：丁小余指导老师：丁小余 教授教授2012.12.26二、国内外的研究现状二、国内外的研究现状及趋势及趋势五、五、本题目的创新之处和可预期的创造性成果本题目的创新之处和可预期的创造性成果一、一、论文选题的理由或意义论文选题的理由或意义三、三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标、研究内容和拟解决的关键问题四、四、拟采取的研究方法、研究手段、技术路线、拟采取的研究方法、研究手段、技术路线、实验方案及可行性分析实验方案及可行性分析主要内容主要内容主要内容主要内容年度研究计划、
2、可能遇到的困难和问题年度研究计划、可能遇到的困难和问题及相应的解决办法及相应的解决办法687有关的研究工作积累和已取得的研究工有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩作成绩已具备的研究条件，尚缺少的研究条件和已具备的研究条件，尚缺少的研究条件和拟解决的途径拟解决的途径一、论文选题的理由或意义一、论文选题的理由或意义石斛，兰科植物之一，主要石斛，兰科植物之一，主要分布于亚洲热带和亚热带分布于亚洲热带和亚热带；对生长条件要求极其苛刻对生长条件要求极其苛刻，分布在分布在崇岭、悬崖峭壁之上，崇岭、悬崖峭壁之上，自然繁殖率极低。千百年来，自然繁殖率极低。千百年来，铁皮枫斗一直作为铁皮枫斗一直作为“九大仙
3、九大仙草草”之首，和灵芝、人参、之首，和灵芝、人参、冬虫夏草等一并被列为上品冬虫夏草等一并被列为上品中药中药；另外，其花也可作观；另外，其花也可作观赏之用赏之用端粒系统端粒系统端端粒是粒是真核细胞线性染色真核细胞线性染色体末端的一组重复体末端的一组重复DNA序列序列，通常由富含鸟嘌呤核苷酸，通常由富含鸟嘌呤核苷酸(G)的短的串联重复序列组成。的短的串联重复序列组成。功能：功能：1.维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性2.起细胞分裂计时器的作起细胞分裂计时器的作用用端端粒酶是一种粒酶是一种RNA与蛋白与蛋白的复合体，它以自身的复合体，它以自身RNA上上的一个片段为模板通过逆转的一个片段为模板通过
4、逆转录合成端粒重复序列，并通录合成端粒重复序列，并通过一种过一种RNA依赖性聚合酶依赖性聚合酶（如逆转录酶）机制加到染（如逆转录酶）机制加到染色体色体3末端以延伸端粒。末端以延伸端粒。三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题通过测定石斛属的不同种端粒长度和端通过测定石斛属的不同种端粒长度和端 粒酶活性来解决有关石斛年龄的问题粒酶活性来解决有关石斛年龄的问题三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究内容研究内容一.如何快速建立组织培养快繁体系获得石斛原球茎、幼苗等材料二.测定三种石斛的端粒酶活性及石斛端粒酶最佳反应
5、体系的构建。三.测定三种石斛的端粒长度。四.建立石斛属的年龄与端粒长度、端粒酶活性的数学模型，分析其关系。三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题拟解决的关键问题：1.应用TRAP法检测石斛属端粒酶活性。2.应用Southern杂交技术检测出石斛属端粒长度。四、四、拟采取的研究方法、研究手段、技术路线、实验方案及可行性分析拟采取的研究方法、研究手段、技术路线、实验方案及可行性分析（一）研究方法、实验方案：（一）研究方法、实验方案：1.利用梯度分析建立有效的组织培养快繁体系。分别从基本培养基种类、光照周期、温度、光照强度等因素对组织培养体系进行优化，构建快
6、速繁殖石斛的方法。2.利用CHAPS裂解液提取石斛的端粒酶并用改进TRAP法进行其活性检测。3.利用Southern杂交技术测量、分析石斛的端粒长度。4.根据不同年龄的石斛端粒酶活性和端粒长度建立起石斛属的年龄与端粒长度、端粒酶活性的数学模型。TRAP（端粒重复序列扩增法）法检测端粒酶活性：TRAP法是采用PCR技术放大端粒延伸产物这一原理而建立的方法；利用CHAPS裂解液从样品中提取端粒酶蛋白,前导引物TS在端粒酶自身逆转录酶的催化下合成端粒末端重复序列,然后将端粒酶灭活,在加入反向引物CX 和Taq酶将反应产物进行PCR扩增,反应体系经过非变性聚丙稀酰胺电泳和显影检测,获得间隔6bp的梯状
7、条带。端粒酶蛋白的提取及检测端粒酶蛋白的提取及检测引物设计引物设计端粒酶延伸、加尾、端粒酶延伸、加尾、PCR扩增扩增聚丙烯酰胺电泳聚丙烯酰胺电泳材料采集，种质保存材料采集，种质保存技术路线图技术路线图石斛端粒长度检测基因组总基因组总DNA的提取（的提取（CTAB）Hinfl酶切检测酶切检测southern杂交法测定端粒长度杂交法测定端粒长度软件分析（软件分析（TELOMERIC）材料采集，种质保存材料采集，种质保存石斛端粒酶活性检测与石斛寿命关系分析与石斛寿命关系分析1.试验材料俱全。试验材料俱全。2.试验器材和试验技术在本实验室已熟练掌握，试验器材和试验技术在本实验室已熟练掌握，Southe
8、rn杂交现有文献指导。杂交现有文献指导。3.本人已联系到国内相关领域研究的知名教授。本人已联系到国内相关领域研究的知名教授。四、拟采取的研究方法、研究手段、技术路线、实验方案及可行性分析四、拟采取的研究方法、研究手段、技术路线、实验方案及可行性分析五、本题目的创新之处和可预期的创造性成果五、本题目的创新之处和可预期的创造性成果创新之处：运用与端粒有关的技术首次对石斛年龄进行探讨，首次运用石斛的端粒酶活性和端粒长度建立起石斛年龄预测的数学模型。可预期的创造性成果：（以论文发表为主要成果形式）1.石斛的端粒酶分离及活性测定探究。（论文1篇）2.端粒长度和端粒酶活性与石斛年龄关系的研究。（论文1-2
9、篇）六六.年度研究计划、可能遇到的困难和问题及相应的解决办法年度研究计划、可能遇到的困难和问题及相应的解决办法2011.09-2012.12：对有关石斛进行大量的组织培养及相关影响因素的探究。熟练掌握与实验有关的分子技术。2012.12-2012.09：提取不同年龄段石斛端粒酶活性和端粒长度，进行比较研究 2013.09-2014.03：查阅资料，整理论文。六六.可能遇到的困难和问题及相应的解决办法可能遇到的困难和问题及相应的解决办法 由于本实验室没有进行过相关端粒（酶）研究，加之前人的可参考文献不多，所以，在遇到实验上的问题很难找到解答。本人拟想从以下几方面解决：一.多看相关文献 二.多联系
10、国内外相关导师或有相关研究经验的硕士生。针对端粒重复序列设计的引物和探针可能会要求不同的实验体系，需要进一步的摸索实验条件，尽可能的提高实验效率。七七.与本题目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩：与本题目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩：1.组织培养出大量铁皮石斛、细茎石斛等实验材料；各年龄段石斛材料已获得。2.已详细了解端粒酶提取和端粒长度测定的方法以及相应流程。3.已着手进行石斛属植物的端粒酶的提取及活性检测的实验八八.已具备的研究条件，尚缺少的研究条件和拟解决的途径已具备的研究条件，尚缺少的研究条件和拟解决的途径已具备植物总DNA提取、模板浓度检测、目的基因PCR扩增、序列分析软件等一系列设备。但目前对于端粒长度测定的Southren杂交技术还所需的部分实验设备和实验软件，通过后期的购买或送公司直接杂交可以得到相应解决。参考文献参考文献
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