日化产品抗菌抑菌效果的评价方法征求意见稿.docx

1、QB/T 2738xxxxQB中华人民共和国工业和信息化部 发布xxxx-xx-xx实施xxxx-xx-xx发布日化产品抗菌抑菌效果的评价方法Test methods for evaluating daily chemical products in antibacterial and bacteriostatic efficacy（征求意见稿）QB/T 2738-XXXX代替QB/T 2738-2012中华人民共和国轻工行业标准ICS 71.040.99Y 401前 言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可

2、能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件代替QB/T 2738-2012日化产品抗菌抑菌效果的评价方法。本文件与QB/T 2738-2012相比主要变化如下：修订了规范性引用文件；修订了日化产品抗菌、抑菌效果检验方法分类；增加了菌落计数规定；规定了抑菌效果检验方法（悬液定量法），特殊情况下的菌落计数；修改了部分培养温度及培养时间增加了适用于皂类产品的持续抑菌效果检验方法；删除附录A。本文件由中国轻工业联合会提出。本文件由全国表面活性剂和洗涤用品标准化技术委员会归口。本文件起草单位： 本文件主要起草人：本文件所代替历次版本发布情况为：QB/T 2738-2005、QB/T 2

3、738-2012。19日化产品抗菌抑菌效果的评价方法1 范围本文件规定了具有特殊卫生功能的日化产品抗菌、抑菌效果的检测方法及评价标准。本文件适用于常见洗涤用品的抗菌、抑菌性能测试，其它日化产品也可根据用途选择采用。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检测 菌落总数测定QB/T 2850 抗菌抑菌型洗涤剂消毒技术规范20023 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 抗菌ant

4、ibacterial采用化学或物理方法杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。3.2 抑菌bacteriostasis采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。3.3 载体carrier 试验微生物的支持物。3.4 生物负载bioburden被测试的一个单位物品上承载活微生物的总数。3.5 杀灭率killing rate,（KR）在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值。3.6 杀灭时间killing time, （KT）用于生物指示物抗力鉴定时，指受试指示物样本，经杀菌因子作用后全部样本无菌生长的最短作用时间（min）。3.7 菌落形成单位colony formin

5、g unit,（cfu）在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。3.8 中和剂neutralizer在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与杀菌剂的混悬液中和微生物表面上残留的杀菌剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。3.9 中和产物product of neutralization指中和剂与杀菌剂作用后的产物。4 检验抗菌、抑菌日化产品效果的实验室及无菌操作的基本要求4.1 微生物实验室应采取封闭式布局，建筑应便于清洁、消毒，为避免污染应在相对正压洁净条件下进行。因特殊需要用致病菌作指示菌时，则应在生物安全

6、柜（负压）内进行；4.2 试验开始前，应以湿式方法清洁台面和打扫室内地面，然后以紫外线或其他方法对实验室内空气进行消毒；4.3 实验人员应穿戴工作服、口罩、帽子；进行无菌检验时，需经风淋后进入实验室。然后，正确穿戴好无菌隔离衣、帽和口罩。4.4 每吸取一次不同样液应更换无菌吸管，接种环（针）需在火焰上烧灼灭菌后，方可再次使用。4.5 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.6 要求无菌的试剂，如蒸馏水、磷酸盐缓冲液、培养基、牛血清白蛋白、标准硬水、中和剂等，均需灭菌或过滤除菌。4.7 无菌器材和试剂，使用前须检查容器或包装是否完整，有破损者不得使用。

7、4.8 正在使用的无菌器材和试剂不得长时间暴露于空气中。4.9 移液或接种时，应将试管口和琼脂平板靠近火焰，防止污染。4.10 所有用过的污染器材，应立即放入盛有消毒液的容器中，以防止对周围环境和清洁物品造成污染。4.11 若不慎发生微生物培养物摔碎或其它试验微生物泄漏事故时，不论是否具有致病性，均应立即对污染及可能波及的区域进行消毒处理。4.12 全部试验结束后，应按常规对室内空气和环境表面进行消毒处理。5 样品采集为使样品具有良好的代表性，应于同一批号三个运输包装中至少随机抽取12件最小销售包装样品，其中4件留样，4件做抑菌或杀菌性能测试，4件做稳定性测试。抽样的最小包装不应有破裂，检验前

8、不得启开。6 日化产品抗菌、抑菌效果评价原则6.1 杀菌试验测定方法文件中杀菌试验测定方法用于考核产品的抗菌作用。6.2 抑菌试验测定方法文件中抑菌试验测定方法用于考核产品的抑菌作用。6.3 检验用指示微生物依据产品执行标准或说明书适用范围进行表1中试验菌的选择检测，也可根据产品的使用要求增加其它菌种作为检验菌种。表1 抗菌、抑菌日化产品试验中微生物的选择试验菌名称菌株标准号抗菌、抑菌日化产品适用范围金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538或ATCC 27217手、足、皮肤和黏膜、织物及一般物品表面 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)8099

9、或ATCC 25922或ATCC 11229手、餐饮具、瓜果和蔬菜、织物及一般物品表面白假丝酵母菌（白色念株菌）(Candida albicans)ATCC 10231手、足、皮肤和黏膜铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 15442皮肤和黏膜6.4 作用浓度按产品明示的标准要求进行（未明示的参照QB/T 2850抗菌抑菌型洗涤剂）。6.5 作用时间按产品明示的标准要求进行（未明示的参照QB/T 2850抗菌抑菌型洗涤剂）。6.6 菌落计数 按GB 4789.2食品安全国家标准 食品微生物学检测 菌落总数测定中规定计数。6.7 结果报告测试结果报告是

10、试验情况和结果的书面表达，结果报告至少应包括：a） 试验菌种；b） 作用浓度；c） 作用时间；d） 效果评价结果；e） 对测定结果有影响的其它因素。7 日化产品抗菌、抑菌效果检验方法7.1 日化产品抗菌、抑菌效果检验方法分类日化产品抗菌、抑菌效果检验方法分类见表2。表2 日化产品抗菌、抑菌检验方法分类类别方法名称表示形式适用范围本标准对应章节杀菌试验悬液定量法计时杀菌抗菌型日化产品7.2模拟法计时杀菌抗菌型织物类洗涤剂7.4抑菌试验滞留法滞留抑菌抑菌型人体皮肤清洁产品7.6悬液定量法计时抑菌抑菌型日化产品7.3模拟法计时抑菌抑菌型织物类洗涤剂7.4抑菌型皂类产品7.7抑菌环法计时抑菌抑菌型日化

11、产品7.57.2 日化产品的杀菌效果检验方法（悬液定量法）7.2.1 设备a） 锥形烧瓶；b） 平皿（直径9cm）；c） 量筒；d） 精密pH试纸；e） 无菌试管；f） 无菌刻度吸管（1.0mL，5.0mL，10.0mL）；g） 恒温培养箱；h） 冰箱；i） 菌落计数器；j） 酒精灯；k） 电动混合器；l） 恒温干燥箱；m） 恒温水浴锅；n） 湿热灭菌锅；o） 电子天平；p） 生物安全柜等微生物试验必备仪器。7.2.2 试剂a） 营养琼脂培养基称取蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g，加蒸馏水1000mL溶解，调pH至7.27.4，然后加入琼脂15.0g加热溶解，分装，于121压力

12、蒸汽灭菌20min后备用。b） 沙堡琼脂培养基 称取葡萄糖40.0g、蛋白胨10.0g、琼脂20.0g、加蒸馏水1000mL，将上述成分混合后，加热至完全溶解，调pH至5.60.2，于115压力蒸汽灭菌30min后备用。c） 0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）称取无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g，加蒸馏水1000mL，待完全溶解后，调pH至7.27.4，经121压力蒸汽灭菌20min后备用。d） 硬水（硬度342mg/L）称取氯化钙（CaCl2）0.304g、氯化镁（MgCl26H2O）0.139g，加蒸馏水1000mL，经121压力蒸汽灭菌20min后备用。e） 中和剂几

13、种常见中和剂：1） 硫代硫酸钠5.0g、蒸馏水1000mL。2） 磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂10.0g、甘氨酸10.0g、吐温（80）30.0g、蒸馏水1000mL。3） 磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂3.0g、吐温（80）20.0g、蒸馏水1000mL。4） 吐温（80）20.0g、硫代硫酸钠10.0g、PBS 1000mL。注：1）用于氯型杀菌剂；2）、3）用于非氧化型杀菌剂；4）用于氧型杀菌剂f） 菌液制备1）细菌繁殖体悬液的制备（1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0mL10.

14、0mL营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置361培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于361培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于361培养18h24h，即为第3代培养物。（2） 取菌种第3代14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h24h），用5.0mL吸管吸取3.0mL5.0mL稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0mL吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀。（3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀

15、释液稀释至所需使用的浓度。（4） 细菌繁殖体悬液应保存在4冰箱内备用。应当天使用不得过夜。（5） 怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。2）白假丝酵母菌（白色念株菌）悬液制备（1)取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0mL10.0mL沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置361培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于361培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于361培养18h24h，即为第3代培养物。将其密封后在4保存，时间

16、不得超过6周。（2）试验时，取第3代斜面培养物在沙堡琼脂斜面上连续传代，方法与第3代相同。取第5代或6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h24h），用5.0mL吸管吸取3.0mL5.0mL PBS稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0mL吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌悬浮均匀。（3）菌悬液保存在4冰箱内备用，当天使用不得过夜。（4）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜

17、后观察。7.2.3 中和剂鉴定试验方法为了准确评价所测样品对微生物的杀灭作用，杀菌试验中要求选择适当中和剂。所选中和剂不仅能及时中止抗菌洗剂对微生物的抑杀作用，且中和剂本身与所测样品的反应产物（即中和产物）对微生物无抑制或杀灭作用，对培养基无不良影响。7.2.3.1 中和剂鉴定试验。7.2.3.1.1 中和剂鉴定试验原则见表3。表3 中和剂鉴定试验原则试验分组第1组第2组第3组第4组第5组第6组杀菌剂菌液培养（杀菌剂菌液）中和剂培养中和剂菌液培养（杀菌剂中和剂）菌液培养阳性菌数对照阴性对照试验目的观察试验样液中的杀菌剂对试验菌有无杀灭或抑制能力观察样液中残留杀菌剂被中和后，受到杀菌剂作用后的

18、试验菌是否能恢复生长观察中和剂是否抑菌观察中和产物，或未被完全中和的残留杀菌剂对试验菌的生长繁殖是否有影响阳性对照组阴性对照组7.2.3.1.2 中和剂鉴定试验见表4。表4 中和剂鉴定试验（悬液定量法）试验分组第1组第2组第3组第4组第5组第6组分别取菌悬液a0.1mL加入对应1-5组试验样液b5.0mL试验样液5.0mL中和剂5.0mL中和产物c5.0mLPBS5.0mL作用至预定时间，分别吸取混匀液0.5mL加入对应组混匀作用10min，分别取混匀液0.5mL加入对应组PBS4.5mL中和剂4.5mL中和剂4.5mL中和产物4.5mLPBS4.5mL作用10min取原液或稀释液0.5mL接

19、种平板（2个/样本）用PBS 10倍系列稀释用中和剂10倍系列稀释用中和剂10倍系列稀释用中和产物10倍系列稀释用PBS 10倍系列稀释PBS中和剂各1.0mL接种平板然后，倾注平板置361培养48h2h，计数菌落数，按稀释倍数计算出回收菌数（cfu/mL）a菌悬液浓度及制备：用PBS将试验菌悬液7.2.2.f稀释，要求浓度为取0.1mL滴于5.0mLPBS液内，回收菌数为 1104cfu/mL9104cfu/mL。b试验样品用无菌标准硬水稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。c取试验样液1.0mL与中和剂9.0mL混合，作用10min后制成中和产物。7.2.3.2 中和剂评价规定a） 1组

20、不长菌或明显少于2组。b） 2组有菌且较第一组为多，同时菌数明显少于3、4、5组，1、2组菌数符合下表。表5 中和剂鉴定试验合格标准中对第1组与第2组菌落数的要求第1组平板平均菌落数第2组平板平均菌落数05X(110)（X+5）Y（10）（Y+0.5Y）c） 3、4、5组菌数相似，回收菌量在1104cfu/mL9104cfu/mL之间，并且其组间误差率15。d） 6组无菌生长。e） 三组平均菌数=（3组菌数+4组菌数+5组菌数）3f）符合上述所有评价项目的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中和产物对指示菌无毒害，判定为该试验样品的中和剂。7.2.4 杀菌试验操作步骤a）

21、 用PBS液将试验菌悬液（7.2.2.f）稀释，要求浓度为：取0.1mL滴于5.0mL对照样液(PBS)内，回收菌数为11049104cfu/mL。b） 将试验样品用无菌标准硬水稀释至规定的浓度。c） 吸取试验样品原液或其稀释液5.0mL放入灭菌试管中，20恒温5min（皂类产品30）。d） 吸取试验菌液0.1mL加入到含5.0mL样品的试管中，迅速混匀，并立即计时。e） 作用至设定时间后，取试验菌与样品的混合液0.5mL，加入到含4.5mL经灭菌的中和剂中，混匀。f） 中和10min后，吸取样液（或作适当稀释后，取其中23个稀释度的稀释液）1mL，置于灭菌平皿内，每个样液或稀释液接种两个灭菌

22、平皿。用凉至4045的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（白色念株菌）15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，361培养48h2h（细菌）或72h3h（白色念株菌）后，做活菌菌落计数。g） 以PBS代替试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品。h） 实验重复3次，求其平均值。7.2.5 计算公式杀菌率按式（1）计算。杀菌率（）（1）式中：对照样品平均菌落数；试验样品平均菌落数。结果保留整数。7.2.6 活菌计数中误差评价活菌计数中平板间菌落数误差率、稀释度间菌落数误差率不宜超过10，对误差率的自检，可按式（2）式（7）计算。 （2） （平板间菌落平均数-各平板菌落数）

23、的绝对值之和平板间菌落数平均差= （3） 平板总数 平板间菌落数平均差平板间菌落数误差率=100（4） 平板间菌落平均数 稀释度间菌落平均数=（5） （稀释度间菌落平均数-各稀释度菌落数）的绝对值之和稀释度间菌落数平均差=（6） 稀释度数稀释度间菌落数平均差稀释度间菌落数误差率= 100（7）稀释度间菌落平均数7.2.7 产品抗菌效果评价将测试结果填入表6，评价产品的抗菌效果。当杀菌率90，表明此条件下产品有抗菌效果。表6 抗菌效果评价试验菌种a)作用时间（min）作用浓度效果评价a)试验菌一栏填入具体的测试菌种，对于多个菌种的测定结果，分别进行效果评价。7.3 日化产品的抑菌效果检验方法（悬

24、液定量法）7.3.1 设备同7.2.17.3.2 试剂同7.2.27.3.3 抑菌试验操作步骤a） 用PBS液将试验菌悬液(7.2.2.f)做适当稀释，要求浓度为：取0.1mL滴于5.0mL对照样液（PBS）内，回收菌数为11049104cfu/mL。b） 将试验样品用无菌标准硬水稀释至规定的浓度。c） 吸取试验样品原液或其稀释液5.0mL放入灭菌试管中，20恒温5min（皂类产品30）。d） 吸取试验菌液0.1mL加入到含5.0mL样品的试管中，迅速混匀，并立即计时。e） 作用至设定时间后，取试验菌与样品混合液0.5mL，加入到含4.5mL经灭菌的PBS试管中，充分混匀。f） 放置10min

25、后，吸取样液（或作适当稀释后，取其中23个稀释度的稀释液）1mL，置于灭菌平皿内，每个样液或稀释度接种两个灭菌平皿。用凉至4045的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（白色念株菌）15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，361培养48h2h（细菌）或72h3h（白色念株菌）后，做活菌菌落计数。注：若接种低稀释度样液的平板无菌落生长，但接种高稀释度样液的平板有菌落生长，按无菌落生长计数。g） 以PBS代替试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品。h） 实验重复3次，求其平均值。7.3.4 计算公式。抑菌率按式（8）计算。（8）式中：对照样品平均菌落数；试验样品平均菌落数

26、结果保留整数。7.3.5 误差评价同7.2.67.3.6 产品抑菌效果评价将测试结果填入表7，评价产品的抑菌效果。当抑菌率90，表明此条件下产品有较强抑菌效果；当抑菌率50且不足90时，表明此条件下产品有抑菌效果。表7 抑菌效果评价试验菌种a)作用时间（min）作用浓度效果评价a)试验菌一栏填入具体的测试菌种，对于多个菌种的测定结果，分别进行效果评价。7.4 织物类洗涤剂抗菌或抑菌效果检验方法（模拟法）7.4.1 原理本方法通过模拟洗衣机的洗衣过程，检测洗衣粉（剂）等织物类洗涤产品的抗菌或抑菌效果。7.4.2 设备a） 不锈钢转轴（由一条直径0.16cm不锈钢丝制成，如图1） 俯视图 侧面图

27、图1 缠绕测试布条的不锈钢转轴b） 有金属螺盖的玻璃罐（容积为470mL，可高压灭菌，并可放入转轴的广口罐），将罐口覆盖牛皮纸，加盖，于121灭菌25min备用。c） 转动速度为45r/min60r/min的滚动摇床d） 可调恒温水浴箱e） 吸管（1mL、 5mL、10mL）f） 培养皿g） 铺有滤纸的玻璃培养皿h） 细菌保存管i） 细菌培养箱j） 涡流振荡器k） 棉布（32支纱/cm32支纱/cm平织棉布）l） 别针、镊子、无菌手套、3mm5mm玻璃珠、秒表、载体布片2.5cm3.8cm（见测试棉布制备。）7.4.3 试剂a） 营养琼脂(同7.2.2.a)b） 营养琼脂A：在营养琼脂中另加入

28、1.5的琼脂。c） 胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）称取胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，加蒸馏水1000mL溶解，调节pH为7.20.2，经121压力蒸汽灭菌后备用。 d） 牛血清白蛋白溶液（3）称取牛血清白蛋白3.0g，加蒸馏水100mL，溶解后用微孔滤膜（孔径为0.45m）过滤除菌，冰箱保存备用。e） 标准硬水（同7.2.2.d）f） 非离子浸湿剂称取5.0g烷基酚聚氧乙烯醚，5.0g碳酸钠，加蒸馏水1000mL溶解。g） 洗涤液移取1.5g非离子浸润剂（7.4.3.f），1.5g碳酸钠，加蒸馏水3000mL溶解。h） 中和剂（经中和剂鉴定试验合格，同7.2.3）i

29、 吐温80（过滤除菌）7.4.4 试验准备a） 测试棉布的制备将大约300g测试棉布加入3L洗涤液（7.4.3.g）,加热煮沸1h。取出棉布，在煮沸的去离子水中清洗5min。然后放入凉的去离子水中5min，以去除残留的洗涤液，最后将棉布晾干。b） 测试棉布和转动支架的准备取处理过的棉布，剪成5cm宽，重量为15g1g的布条，将其一端插入固定在测试转动支架的水平方向的外边，然后在3条水平支架间以足够的张力缠绕12个整圈，将布条的另一端用不锈钢别针固定在前一圈布条上。最后以121压力蒸汽灭菌15min，备用。c） 细菌悬液的制备：用PBS液将试验菌悬液（7.2.2.f）稀释，要求浓度为1108c

30、fu/mL5108cfu/mL，然后加入等体积的牛血清白蛋白溶液（3）。d） 染菌载体的制备每片载体布片（7.4.2.l）接种20L菌悬液，放回培养皿中，加盖，于361培养箱中干燥20min。e） 测试样品的制备：试验开始前20min，将盛有265mL硬水的玻璃罐放入水浴中恒温至测试温度251，然后将被测试样品按规定的浓度（即抗菌、抑菌试验的作用浓度）加入混合溶解，保持该溶液的温度与测试温度251一致。7.4.5 杀菌或抑菌试验操作步骤a) 将两片染菌载体（7.4.4.4）放入转动支架的第6和7层布条之间，将第3片放入第7和8层布条之间。b) 以无菌操作方式将转动单元（支架、布条和染菌载体）放

31、入含有测试样品的玻璃罐中，加盖。c) 玻璃罐固定在摇床上，滚动旋转洗涤至设定时间（即抗菌、抑菌试验的作用时间），取下玻璃罐。d) 以无菌操作方式，取出转动单元，取下3片染菌载体，放入到含有30mL中和剂（在测试抑菌产品的抑菌作用时，以含0.5吐温80的PBS30mL代替中和剂，其它操作步骤均与测试抗菌产品试验相同。）的试管中，在振荡器中混合10s。然后振打200次，用PBS做10倍系列稀释，并选择适宜稀释度样液接种TSB平板。每个稀释度接种两个平板。e) 以含0.5吐温80的PBS代替试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品组。f) 菌数对照组：将3片染菌载体加入含有30mL 0.5%吐温8

32、0的PBS试管中，在振荡器震荡10s，然后震打200次，用PBS做10倍系列稀释，并取适宜稀释度样液1.0mL，以倾泻法接种TSA平板，每个稀释度接种2个平板。g) 将试验组、对照组及菌数对照组平板倒置于361培养箱中，培养48h2h，计数菌落数。h) 试验重复三次，求其平均值。7.4.6 计算公式杀菌率或抑菌率按式（9）计算。杀菌率或抑菌率（）（9）式中：对照样品平均菌落数；试验样品平均菌落数。结果保留整数。7.4.7 产品抗菌或抑菌效果评价抗菌效果评价见7.2.7，抑菌效果评价见7.3.67.5 日化产品的抑菌效果检验方法（抑菌环法）7.5.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度

33、梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。7.5.2 设备a) 刻度吸管（1.0mL，5.0mL）；b) 抑菌剂载体（5mm直径园形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120烤干2h，保存备用）；c) 电动混合器；d) 微量移液器（5L-50L，可调式）；e) 游标卡尺。7.5.3 试剂a) 营养琼脂培养基（同7.2.2.a或b）b) 菌悬液（同7.2.2.f）7.5.4 抑菌试验操作步骤a） 抑菌片的制备对液体抑菌试验样品，取无菌干燥滤纸片，每片滴加实际使用浓度的抑菌试验样品溶液20L，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置恒温箱（37）中烘干，或置室温

34、下自然干燥后备用。b） 对照样的制备取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水20L，干燥后备用。c） 试验菌的接种用无菌棉拭子蘸取浓度为1104cfu/mL9104cfu/mL试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂沫3次。每涂抹1次，平板应转动60，最后用棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。d） 抑菌试验样片贴放每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片对照样片，共计5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37恒温箱，培养16h18h后观察

35、结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。试验重复3次。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。7.5.5 产品抑菌效果评价抑菌环直径大于7mm者，产品有抑菌作用。抑菌环直径小于或等于7mm者，产品无抑菌作用。7.5.6 注意事项a） 每次试验均应设置对照组，不可省略。在报告中亦必须将对照组的结果列出。b） 接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大；浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减小。c） 应保持琼脂浓度的准确性，同时培养皿中倾倒琼脂量为15mL18mL，否则可影响抑菌环的大小。d） 培养时间不得超过18h。培养

36、过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。e） 抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。7.6 人体皮肤清洁类产品抑菌效果检验方法（滞留法）7.6.1 原理本试验通过模拟适合细菌生长、繁殖和可能产生感染的皮肤条件下，使用随机性、双盲的、配对比较的方法检测人体皮肤清洁类产品在一定时间内作用于人体皮肤上的滞留抑菌效果。7.6.2 设备a） 恒温箱；b） 金属筒（直径2.2cm、高度3cm）；c） 一次性接种环（直径4mm）；d） 小塑料碗（直径2.2cm，高2.5mm）；e） 胶带；f） 尼龙刮菌棒；g） 玻璃弯棒。7.6.3 试剂a） 胰蛋白胨大豆肉汤培养基（

37、TSB）（同7.4.3.c）；b） 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：称取胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂16.0g，加蒸馏水1000mL，调节pH至7.20.2，经121压力蒸汽灭菌后使用。c） 0.03mol/L的磷酸盐缓冲液（同7.2.2.c）；d） 70酒精；e） 羊血；f） 脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO9）； g） 外用抗生素软膏。7.6.4 样品：试验品按顺序编号分为25组。每组2个，一个为按规定的作用浓度配制的测试样品，另一个为不含抑菌剂的对照样。7.6.5 抑菌试验操作步骤a) 调整阶段试验开始前7d至14d，受试者使用不含抗菌、抑菌成分的日化产品进行日

38、常的肤发的清洁。此阶段持续至少7d，但不超过14d。b) 清洗阶段清洗阶段共3d，受试者每天用抑菌样品清洗一侧前臂，用对照品清洗另一侧前臂，清洗过程如下：1) 先清洗左臂，用流动水（水温应保持在3537）打湿前臂内侧；2) 用样品从手腕至臂肘上下摩擦15s；3) 用手在涂有样品的手臂上上下摩擦泡沫45s；4) 用流动的清水冲洗前臂15s，不要搓擦；5) 用纸巾沾干前臂，不要搓擦；6) 重复以上步骤清洗右臂；7) 按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂3次，每次间隔至少一个小时，记录最后一次清洗时间。然后按规定的作用时间间隔要求，进行滞留效果检测。第9次清洗前臂以后，受试者不能洗澡、沐浴或洗净前臂，

39、直到试验结束。清洗前后每组试样的重量及受试者完成清洗的情况，须记录下来。c) 试验阶段清洗阶段的第四天（最后一次清洗后的12h24h内），在受试者每只前臂上划出一个试验区并进行接种、封包和回收存活细菌，具体步骤如下：1) 将金黄色葡萄球菌（ATCC 27217）连续转种3代，取第3代培养物接种于胰蛋白胨大豆内汤培养基（TSB）中，在361的条件下培养20h2h。然后用胰蛋白胨大豆肉汤适当稀释菌悬液，使菌悬液浓度约为1108cfu/mL5108cfu/mL。2) 细菌接种在受试者的每只前臂中间部位（不要在手腕和肘皱褶处），用带有印墨直径为3.0cm的玻璃量筒扣在皮肤上，划分出一个试验区。使用加样

40、器取10L上述菌悬液，接种于前臂试验区，菌数为11065106cfu/试验区。用一次性接种环，把接种物涂成一圆形，使其与试验区边缘应有4mm5mm的距离。3) 封包细菌接种后立即用小塑料碗扣于染菌区上面，再用胶带将小塑料碗固定在皮肤上，记录封包的时间。4) 回收存活细菌接种后2h5min对前臂上接种的区域进行取样。将金属筒放置于试验区中间部位，不要接触到盖有印墨的边缘。将1mL含0.1AEO9的0.03mol/L磷酸盐缓冲液吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤60s，将筒内液体吸移至试管内，再加1mL含0.1AEO9的0.03mol/L磷酸盐缓冲液，对该区域内的皮肤进行第2次

41、刮洗30s，将第2次擦洗的液体，注入含第1次刮洗液体的试管中。5) 试验区试验后的消毒处理一个试验区采样之后，需用70的酒精对试验区进行消毒。然后对另一个试验区以同样方法进行采样，采样结束后，先用70的酒精对试验区进行消毒，然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理，处理后清水冲洗，擦干，再涂少量的抗生素软膏。6) 平皿接种与培养对每一个取样进行平皿接种，以0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）对样品进行10倍系列稀释。选适当稀释度取0.1mL接种于2个含5%羊血的TSA平皿表面，用玻璃弯棒涂匀，在361的培养箱中培养48h2h，计数菌落数。7.6.6 计算公式抑菌率按式（10）计算。（10）式

42、中：对照样品平均菌落数；试验样品平均菌落数。结果保留整数。7.6.7 产品抑菌效果评价同7.3.6。7.6.8 试验要求a) 试验人次不得少于16人次。b) 受试者录用标准1) 年龄介于18岁至65岁的男性或女性的身体健康者；2) 前臂应完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题；3) 同意在整个试验期间，避免使用抗菌、抑菌洗液和乳膏、局部固醇类药物和全身或局部使用抗生素； 4) 同意在清洗阶段使用非药物香皂或洗液洗澡和淋浴，但受试者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂后，不洗澡，淋浴或洗净前臂，直到试验结束；c) 排除受试者的标准 如果受试者有下列情况之一，不能被录用参加试验。1) 同时参加另外一个临床试

43、验；2) 在过去的14d中，参加过任何一种形式的关于清洁手或手臂的试验；3) 对香皂、去污剂、香水或青霉素过敏；4) 怀孕妇女；5) 诊断患有糖尿病、肝炎、艾滋病（HIV阳性）、器官移植者。d) 其它试验限制1) 受试者不得使用其它清洁用品；2) 受试者应避免洗热水盆浴和游泳；3) 受试者应避免接触未干的油漆、涂料或者其它溶剂；4) 受试者应避免在手腕处和前臂上喷洒香水。e) 在试验完成后的48h72h内，需检查前臂上有无小脓疱、水疱，隆起的红色痒疱。出现这些情况的受试者应尽快通知检验单位。7.7 持续抑菌效果检验方法（体外模拟法，适用于皂类产品）7.7.1 设备a) 超净工作台；b) 恒温培养箱；c) 水浴锅；d) 移液器；e) 无菌剪刀或者刀片，镊子；f) 250ml带盖无菌瓶子。7.7.2 试剂和材料：a) 测试样品及对照样品：测试样品为含有抗/抑菌活性成分的皂类，对照样品为同配方同工艺但仅不添加抗/抑菌成分的皂类。也可选用以下配方的脂肪酸钠皂为对照参比样品。对照参比皂制作：以脂肪酸配比氢氧化钠碱液经酸碱中和反应制成块状参比皂。所用试剂材料为工业级及以上纯度。按照7份C12脂肪酸（月桂酸），35