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1、分子生物学综合实验 红色荧光蛋白（RFP）的原核表达 报告题目 红色荧光蛋白（RFP）的原核表达作者姓名饶慧班级学号0802班/2008114010214指导教师王友如完成时间2011年02月生物学实验教学中心目 录 引言11 实验材料及实验仪器41.1实验材料41.2实验仪器52 实验方法72.1 重组质粒的构建72.2工程菌株的活化72.3诱导表达82.4 SDS-PAGE检测表达蛋白83 结果与分析9总结10参考文献11致谢13 红色荧光蛋白的原核表达 饶慧（指导老师：王友如）（湖北师范学院生命科学学院 生物科学0802班 湖北 黄石 435002）摘 要 实验目的：研究红色荧光蛋白（R
2、ed Fluorescent Protein，RFP）基因在大肠杆菌中原核表达。 实验方法：通过分别将DH-5(pDsRed-N1)和DH-5 (pET-28)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-RFP，将重组质粒通过转化的方法把含红色荧光蛋白（RFP）外源基因转入大肠杆菌体内进行表达，再用IPTG诱导RFP基因表达，可以看到显现红色，最后根据SDS-PAGE电泳结果，判断RFP基因在大肠杆菌中是否成功表达。 实验结果：结果显示构建的重组质粒pET-28-RFP在E.coli中成功表达。关键词 红色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达 Prokaryote Expression
3、of Red Fluorescent Protein (RFP) Rao Hui (Class 0802, College of Biology Science ,Hubei Normal University, Huangshi, Hubei,435002 ) Abstract Objective: To study the expression of the RFP gene in the E.coli. Methods: Extract the plasmid of the DH-5 (pDsRed-N1) and DH-5 (pET-28). Then the two plasmids
4、 are cut by enzyme and are connected to form pET-28a-RFP recombined plasmid. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of RFP, into E.coli for expression, through transformative method. The expression of RFP gene can be induced by the IPTG and then we can see red. Finally, judgi
5、ng whether the RFP gene has expressed successfully in E.coli according to the results of SDS-PAGE electrophoresis. Results: The results suggest that pET-28-RFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords Red Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induce
6、d Expression分子生物学综合实验 红色荧光蛋白的原核表达 饶慧（指导老师：王友如）（湖北师范学院生命科学学院 生物科学0802班 湖北 黄石 435002）引言 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白在某种定义下可以说是革新了生物学研究运用荧光蛋白可以观测到细胞的活动，可以标记表达蛋白，可以进行深入的蛋白质组学实验等等。特别是在癌症研究的过程中，由于荧光蛋白的出现使得科学家们能够观测到肿瘤细胞的具体活动，比如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生。1999年，Ma
7、tz 等2从印度洋太平洋地区的珊瑚虫中分离出6 种与绿色荧光蛋白(green fluorescentproteins ,GFP) 同源的荧光蛋白,并鉴定了它们的光谱性质。红色荧光蛋白(Red Fluorecent Protein,RFP)基因是从海葵Discoso-masp中分离出的一种新的荧光蛋白基因,其蛋白质的最大吸收光谱为583 nm，不需要任何预处理便可检测到3。红色荧光蛋白因其红荧光较强的组织穿透力，已被广泛用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因，但作为原核细胞表达的报告基因还鲜有报道4。 自1999 年红色荧光被发现后,引起了科学家广泛的兴趣,人们对其理化性质和发光机制
8、进行了深入的研究；通过对其修饰,人们得到了聚集程度低、成熟速率更快、发光强度更强和发射波长更长的突变株5。许多红色荧光蛋白已经具备了优良的性质，并广泛应用于生命科学研究.。但即使是性能优良的红色荧光蛋白，仍然有较大的定向改造余地。 例如，发展高亮度、远红外发射的单体荧光蛋白，将在深部组织成像方面有重要意义6。PCR技术是Kary Mullis在1985年建立起来的在细胞体外合成DNA的一种方法。依DNA半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA的一定
9、次数的重复循环，使包括在两个引物5端限定的特异性片段形成指数式积累。整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的特意的DNA拷贝，这一特点使PCR技术很快被应用到了分子生物研究的广大领域7。大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点8。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统9。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择
10、的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株10。 随着人们对原核和真核生物基因调控的了解，通过综合控制基因转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株，以满足表达不同性质、要求的目的基因的需要。在原核细胞中表达蛋白质的载体常用启动子有T7启动子、Trp启动子-色氨酸启动子、Tac启动子、T7噬菌体中基因10的启动子及Lac启动子等。Lac启动子受分解代谢系统活化蛋白和cAMP的正调控和阻遏物的负调控，当加入乳糖或某些类似物IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构型改变，阻遏蛋白不再能与操纵基因结合，从而使结构基因表达。根据
11、原核生物基因表达特点选着载体进行目的基因克隆，然后转入相应的菌种中表达目的蛋白质11。蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动；反之则向负极移动，这种带电的颗粒在电场中泳动的现象称为电泳（electrophoresis）。不同的蛋白质由于等电点不同，在电场中的泳动速率也不同，因此应用电泳技术很容易实现对蛋白样本的分离与分析。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE
12、）是目前用于测定蛋白质亚基分子量的常规方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂（过硫酸铵）和增速剂（N,N,N,N-四甲基乙二胺）的氧化-还原作用下聚合而成的。凝胶的有效孔径与它的总浓度T成反变关系，在高浓度时，凝胶孔径小，可以筛分分子量小的多肽；低浓度时，凝胶孔径大，则可筛分大分子蛋白质。工作时，凝胶由浓缩胶和分离胶两部分组成，浓缩胶浓度低、孔径大，较稀的样品经过大孔径凝胶的迁移作用可被浓缩至一极窄的区带，以提高样品中各组分在分离胶中的分辨率。SDS是一种阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠。还原剂二硫苏糖醇 (dithiothreito
13、l, DTT）或巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样本中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子将被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合,可形成带负电荷的蛋白质亚基-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异；然而，蛋白质亚基-SDS胶束的长轴长度与亚基分子量的大小成正比。因此，当这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率不再受蛋白质分子原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15 KD到200 KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。蛋白质SDS-PAGE常用于蛋白质
14、分子量的测定，蛋白质纯度的分析，蛋白质浓度的检测，免疫印迹（Western Blot）的第一步，蛋白质修饰及免疫沉淀蛋白的鉴定等12。 研究红色荧光蛋白在大肠杆菌体内的原核表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-RFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，并用IPTG诱导其在大肠杆菌体内进行表达，最后用SDS-PAGE检测是否诱导表达成功。根据电泳结果得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。1 实验材料及实验仪器 1.1实验材料E.coli DH-5(pDsRed-N1)和 E.coli DH-5(pET-28)菌株（由本实验室保存）；溴酚蓝；TEMED；IPTG(1 mM)；标准
15、蛋白；SDS 10%(W/V)；LB液体培养基；卡那霉素100 mg/mL； 过硫酸铵10 mL10%(W/V) (现配现用）； TrisHCl（pH 6.8）8 ：在40 mL水中溶解6.05 g Tris碱（0.5 mol/L），用1 mol/L HCl调校至pH 6.8，补加水至整体积100 mL，用0.45 um滤膜过滤，再加入0.4 g SDS 0.4%(m/V) 溶解后于4C保存； 30%凝胶贮备液丙烯酰胺 29%（W/V）N,N-亚甲基-双丙烯酰胺1% （W/V） 15 %的分离胶双蒸水4.7 mL1.5 mol/L TrisHCl（pH8.8）5.0 mL10 % SDS200
16、 uL30 %丙烯酰胺溶液10 mLTEMED10 uL10 % 过硫酸铵100 uL总体积 20 mL 混匀后加入电泳槽的玻璃板夹缝中，并在胶面上加入约2 mL双蒸水，1 h 后等胶自然凝聚，去净双蒸水，并在夹缝中放入梳子； 5%的浓缩胶 双蒸水 5.8 mL 0.5 mol/L TrisHCl （pH6.8） 2.5 mL 10 % SDS 100 uL 30 % 丙烯酰胺溶液 1.6 mL TEMED 10 uL 10 % 过硫酸铵 50 uL 总体积 10 mL 混匀后加入夹缝中并没过梳孔，待凝聚后小心拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗加样孔，清除未凝聚的丙烯酰胺；Tricine样品缓冲液（2
17、）TrisHCl/SDS pH 6.8（0.08 mol/L）2 mL甘油24 %（V/V）(3.0 g)2.4 mLSDS 8 % (m/V)0.8 gDTT（0.2 mol/L）0.31 g考马斯亮蓝G-250 0.02 % (m/V)2 mg 总体积 10 mL 固定液： 甲醇：水：乙酸（30:10:60） （V/V/V）； 脱色液： 甲醇：水：冰醋酸（4.5:4.5:1） （V/V/V）； 染色液： 0.25 g考马斯亮蓝(R250)溶解于100 mL脱色液。 1.2实验仪器1. BCM-1000生物洁净工作台 苏州净化设备有限公司2. THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器 太仓市实验设备
18、厂3. DYY-12型电泳仪 北京市六一仪器厂4. TGL-16C台式离心机 上海安亭科学仪器厂5. HJ-3控温磁力搅拌器 江苏金坛市金南仪器厂6. 雷磁PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司7. AB204-N 电子天平 Mettler-Toleda Group8. KDM型调温电热套 武汉精华科教仪器有限公司2 实验方法 2.1 重组质粒的构建图1重组质粒pET-28a-RFP的构建流程Fig. The formed technological process of pET-28-RFP recombined plasmid2.2工程菌株的活化 2.2.1 将卡那霉素100 mg
19、/mL以1:1000 的比例加入LB液体培养基中，再将LB液体培养基取2 mL分装至无菌红帽试管中。 2.2.2 取活化的工程菌株10 uL于红帽试管中。 2.2.3 37 C条件下180 rpm过夜培养。(注意问题：所有操作均在无菌条件下进行,注意超净工作台的操作步骤及注意问题。)2.3诱导表达 2.3.1 将过夜培养物按照1:100的比例加入至含卡那霉素的培养基中，37 C条件下180 rpm培养2-4 h至对数期。 2.3.2 将IPTG(1 mM)按照1:1000的比例加入至培养基中，每隔2 h观察培养基的颜色变化。设置一个对照（不加入IPTG）。(注意问题: 所有操作均在无菌条件下进
20、行。)2.4 SDS-PAGE检测表达蛋白 2.4.1配制15 % 的分离胶 2.4.2配制5 % 的浓缩胶 2.4.3样品制备取菌液10000 r/min 离心2 min，弃上清，沉淀与2上样缓冲液1:1混匀，在沸水中水浴3-5 min，取出，10000 r/min 离心2 min，上清液即为样品。 2.4.4上样与电泳将样品及标准蛋白加入点样孔后，接通电源，恒压电泳至溴酚蓝到离底部约3 cm时，停止电泳。 2.4.5染色与脱色 将分离胶从玻璃板上取下，在染色液中染色1-2 h后，在脱色液中过夜脱色，换保存液保存。 2.4.6拍照保存3 结果与分析 图2 蛋白质的电泳结果Lane 1： Ma
21、rker protein；Lane 2：含质粒pET-28-RFP的菌液总蛋白质样品（阳性对照）；Lane 3：含空载质粒pET-28-RFP的菌液总蛋白质样品（阴性对照）。Fig. 2 the results of the protein electrophoresisLane 1: Marker protein; Lane 2:The total protein samples in bacterium fluid containing pET-28-RFP plasmid (positive contrast); Lane 3: total protein samples in bact
22、erium fluid containing un-loaded pET-28-RFP plasmid (negative contrast).（1）用IPTG诱导表达后试管内菌液呈现红色，说明含外源基因RFP的质粒在大肠杆菌体内成功表达。（2）由图2可以看出，阳性对照比阴性对照多了一条带，即为表达的目的基因（约44 KDa）。说明了阳性对照中质粒重组成功，并成功转入大肠杆菌体内和在其体内成功诱导表达；阴性对照重组质粒未成功转入大肠杆菌体内不含目的基因，故加入IPTG后未能显现红色，且电泳后比阳性对照少了一条带。总结本实验是一个综合性实验，与我们平时的实验相比对我们的要求更多更严。它主要要求我
23、们形成认真思考的习惯，自己查阅本实验的相关文献，分析本实验的目的，通过本实验要达到什么样的结果，达到预计的结果需要通过怎样的方案实现，根据实验需要和自己的相关了解自己设置适合的实验方案，增强我们的思维能力和动手能力，同时也使我们的团队合作精神得到了提高，并学会把我们所学的知识有机的结合到一起。跟我们平时的实验相比较我们的实验素养可以得到很大的提高，有利于我们今后的学习和研究。通过本次实验我深刻的认识到了，在我们做研究的过程中一定要认真，每一步都不能出错，否则将功亏一篑，从头开始。在实验的过程中，制胶的过程出现了一些问题，使得凝胶不能聚合，分析原因可能有：(1)试剂质量差，应使用电泳级别的试剂
24、(2)过硫酸铵和TEMED的量不够或失活，可增加剂量或重配新鲜的储存液 (3)凝胶聚合时温度太低，应以室温为宜。在实验的过程中我们还应该注意的有：1上样时，样品不能沉到加样孔底部，可能是上样缓冲液中甘油含量不足；或是加样孔底部留有聚合的丙烯酰胺。2经过煮沸的样品虽然可以在-20保存数周，但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20取出的样本，上样前应先升至室温，确保SDS沉淀溶解。3注意避免电泳条带弯曲畸变：(1)“微笑” 现象，可能是因为凝胶中间部分温度过高，降低电压便可得到改善 (2)“皱眉”现象，常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀 (3)“拖尾”、“纹理”现象，则多为样品溶解不佳，增加蛋白
25、样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即可克服 (4)“晕轮”效应（holo effect）多为加样过量所致。4非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成，应将染料溶液过滤后再用。参考文献1 贾艳华，李国勋，张杰 荧光蛋白及其应用 2 Matz MV , Fradkov AF , Labas YA , et al . Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species J . Nat Biotechnol , 1999 , 17(10) :969 - 973. 3 龙华，尾里，建二郎，若松佑子，松岛良次 红色荧光蛋白（RFP）
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30、高的敬意和衷心的感谢！当然，本论文的顺利完成，也离不开同学们的关心和帮助。在此真诚感谢他们的耐心指导和大力帮助，使得我们共同前进。在校学习期间，得到同班所有同学的关心和帮助，在此向他们一并表示深深的感谢，愿同窗之间的友谊永远长存。同时，还要感谢大学期间来所有的老师，让我在学好专业知识的同时更全面的发展；感谢生命科学院给了我这片天地以及对我的大力栽培。最后，我要把一份特别的感谢献给我的家人和朋友，感谢他们一直以来对我的关爱与宽容、理解与支持。 珍惜、知足、感恩。 饶慧 2011.04.23 中心地址：湖北省黄石市磁湖路11号邮政编码：435002联系电话：0714-6511613E-mail：网 址：http:/