输血科新生儿溶血病血型血清学检查标准操作规程.docx

1、输血科新生儿溶血病血型血清学检查标准操作规程1、目的：规范血液免疫学产前检查操作，确保试验过程及结果的准确性与可靠性。2、范围：本规程适用于实验室血液免疫学产前检查试验操作。3、职责：经授权的血型实验室试验人员负责血液免疫学产前检查试验过程及报告的发出。4、原理孕妇和丈夫ABO血型不合（0/A、0/B、0/AB、A/B、A/AB、B/A、B/AB）时，孕妇体内的IgG抗A（B）可能会引起新生儿溶血病的发生。本试验通过检测孕妇血清中有无IgG性质的抗A（B）抗体及其效价（应用筑基试剂破坏IgM抗体，检测IgG抗体效价）即可预测ABO系HDN发生的可能性。应用筛选红细胞可检测孕妇血清中是否存在不规

2、则抗体，如果存在，应用谱细胞进行抗体鉴定，确定抗体的特异性，进一步检测非ABo系新生儿溶血病。5、所需设备、材料或试剂：37恒温水浴箱、细胞洗涤离心机、抗-A抗-B血型定型试剂（单克隆抗体）、抗-DRH血型定型试剂（单克隆抗体）、凝聚胺介质试剂、抗人球蛋白试剂（抗TgG、C3d）、（A、B、0）型标准红细胞悬液（25%）商品化筛选细胞、谱细胞、2ME试剂、12X75m试管、塑料滴管。6、检测环境条件：温度:1825；湿度：3070%7、标本要求7. 1标本接收在接收标本时，应尽可能的了解、核对、记录患者的相关资料，包括受血者姓名、年龄、性别、临床诊断、输血史、用药史、妊娠史、标本编码等；8.

3、2检验人员收到被检者产前检查申请按照申请单内容在试管上做标记（用记号笔在试管上标明被检者姓名、性别），保留申请记录。9. 3按照要求进行血液采集。将采好的血液沿试管壁注入已标识的抗凝试管中，反复颠倒混匀，放入2-8C冰箱待用。并填写外来标本交接记录及相关记录。10. 4标本的种类与数量：产前检查需送夫妇血样，血样均需抗凝（EDTA抗凝），女（母）5ml,男3ml。11. 5标本的保存与处理：完成所有试验内容后，要仔细核对实验结果，发出实验报告后，将实验所用的标本原始送检管存于2-8。C冰箱内至少7天以便进行查找和核对，之后交由单位相关部门统一处理。8、试验过程8.1试验前准备8.1.1 从冰箱

4、中取出待检标本放入离心机中离心。8. 1.2取4支12X75mm试管，分别标记丈夫C（细胞管）、丈夫S（血清管）；妻子C（细胞管）、妻子S（血清管）。从标本中分离出血清及红细胞，并按标记分别加入以上4管，然后将红细胞进行三洗（生理盐水），配制成25%红细胞悬液，备用。8.1. 3夫妇ABO血型鉴定、妻子Rh血型鉴定及不规则抗体筛选:8. 2男、女ABO血型不合：8.1.1 中和后的女血清与男细胞和同型细胞，参照抗人球蛋白试验技术操作规程（或聚凝胺介质试验技术操作规程）检测IgG抗-A（B）抗体。8. 2.3女血清做抗体筛选试验,即女血清与0型筛选细胞参照抗人球蛋白试验技术操作规程（或聚凝胺介质

5、试验技术操作规程）检测ABO以外的抗体。如阳性做抗体鉴定12. 2.4测定中和后女血清中IgG抗一A（B）抗体效价参照抗体效价测定操作规程。12.3 、女ABO血型相合:8. 3.1女血清与男细胞，检测女血清中有无针对男方红细胞的抗体9. 3.2女血清做抗体筛选试验，即女血清与0型筛选细胞做间接抗人球蛋白实验（或聚凝胺介质试验技术操作规程），检测ABo以外的抗体。10. 3.3如果抗体筛选阳性，再做抗体鉴定以鉴定抗体的特异性并测定抗体效价。筛选细胞管中反应呈阳性，则可能存在不规则抗体，参照抗体效价测定操作规程应用商品化谱细胞进行抗体鉴定（受血者血清2d+谱细胞Id,离心15秒、3000转/分，

6、观察结果。37C恒温水浴箱中，孵育30分钟，三次洗涤后加入抗球蛋白试剂，观察结果，对照细胞谱确定抗体的特异性）o所检出抗体效价测定参照抗体效价测定操作规程。12.4 IgM抗体破坏试验及抗体效价滴定：12.4.1 验操作：1）取1支12X75mm试管，标记为中和管。2）将受检者血清200微升与2-ME应用液在已标记好的试管内等量混合，加塞置室温30分钟（或37ClO分钟）进行IgM抗体破坏试验。此混合液稀释度为1:2,表示在最终为两体积的溶液中有一体积的血清或在稀释液中有50%的血清溶液。3）取9支12X75Inm试管,分别标记血清稀释度（4、8、16、32、64、128、256、512、10

7、24）o在标记好的试管中分别加入1体积生理盐水。4）取1体积上述破坏IgM抗体的混合液，加入到标记为1:4的血清稀释度管中，使用微量加样器混匀（反复混匀20次）1:4管中的内容物，并转移出1体积到下一稀释度管中。5）继续按相同方法稀释，直至最后一管，从最后一管中移出1体积的稀释血清。6）每管加相应2-5%红细胞盐水悬液Id,离心15秒（3000转/分）.7）37C水浴30分钟，取出后以生理盐水洗涤3次，每次离心1分钟（3000转/分），加入抗-IgG、C3d2d,以3000转/分离心15秒，判读并记录结果。12.4.2 果分析：1）试验操作（8.4.1）中肉眼观察，出现凝集者为仍残留有IgM抗

8、A（B）,记录IgM抗体效价。2）试验操作8.4.1）中肉眼观察IgG抗体效价，产生1+凝集的最高稀释度其倒数即为效价。IgG抗体效价XgM抗体效价2管（4倍）或以上时，结果有效。如果未达到中和效果，延长中和时间（不超过2小时），重复8.4的实验。3）在比较试验中，由于开始血清已被DTT或2-ME稀释过一倍,因此倍比稀释的第一管是4倍稀释,效价至少有3个稀释度以上差异才能算有意义。12.5 、女ABO血型相合:8. 5.1女血清与男细胞，检测女血清中有无针对男方红细胞的抗体9. 5.2女血清做抗体筛选试验，即女血清与0型筛选细胞做间接抗人球蛋白实验（或聚凝胺介质试验技术操作规程）检测ABO以外

9、的抗体。10. 5.3如果抗体筛选阳性，再做抗体鉴定以鉴定抗体的特异性并测定抗体效价。8. 5.4结果分析：1）试验操作（8.4.1）中肉眼观察，出现凝集者为仍残留有IgM抗A（B）,记录IgM抗体效价。2）试验操作（8.4.1）中肉眼观察IgG抗体效价，产生1+凝集的最高稀释度其倒数即为效价。IgG抗体效价XgM抗体效价2管（4倍）或以上时，结果有效。如果未达到中和效果，延长中和时间（不超过2小时），重复8.4.1的实验。3）在比较试验中，效价至少有3个稀释度以上差异才能算有意义。8. 6直接抗人球蛋白试验（子细胞）8.6. 1取受检红细胞，用生理盐水洗涤3次，末次洗涤后将上层盐水倒尽，配成

10、2-5%红细胞盐水悬液.8.6.2取上述2-5%受检红细胞盐水悬液1滴，滴入试管内，加抗球蛋白血清2滴，混匀。8.6.3阳性对照：IgG抗D血清致敏的2-5%D阳性红细胞悬液1滴，加抗球蛋白血清2滴，混匀。8.6.4阴性对照：正常人2-5%D阳性红细胞悬液1滴加抗球蛋白血清2滴，混匀。受检者以及阳性，阴性对照管同时离心3000转，15秒，轻轻混合，观察结果8.6.5结果判读如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者为阳性，不凝集者为阴性。8.7新生儿血清中游离抗体检查：取3支试管，各加入新生儿血清2d,再分别加入2-5%AB、0型红细胞悬液Id,加LiSS液4滴混匀，置37C水浴15

11、分钟，取出后用生理盐水洗涤3次，加抗球蛋白2d,离心3000转15秒看结果。判读结果参照抗人球蛋白试验技术操作规程。新生儿血清中游离抗体检查指示红细胞意义AcBe0十释放出IgG抗A+释放出IgG抗B抗体+（可能包括抗A或抗B）释放出IgG抗-A,B抗体+/-+/-I-释放出A.B.0血型以外的抗体未释放出抗体8.8释放试验:1）热放散法。先将新生儿红细胞用生理盐水洗涤3次，每次离心1分钟（3000转/分），取压积红细胞Im1,加等量盐水，将试管置于56水浴中不断振摇78分钟，取出后置盛有56C热水的离心套管中，立即以3000转/分离心5分钟，取上层释放液，分三管分别加入上述1）所制备酶处理A

12、B、。型5%标准红细胞Id,置37致敏半小时，取出后以生理盐水洗涤3次，每次离心1分钟（3000转/分），加入抗TgG、C3d2d,以3000转/分离心15秒。若放散液与A或B细胞凝集，与。细胞不凝集，可证实新生儿红细胞上致敏有A或B抗体。参照抗球蛋白试验检测项目标准操作规程。2）试剂：三氯甲烷用生理盐水洗涤红细胞至少3次，按要求保留最后一次洗涤液压积红细胞中加入等量的生理盐水，混匀，加总体积之和的三氯甲烷塞住试管口，用力摇动试管1分钟，静止片刻，留取上清放散液，用放散液与指示细胞“AC”“BC”“0C”反应，参照抗球蛋白试验检测项目标准操作规程。3）试剂：酸放散试剂盒用生理盐水洗涤待检红细

13、胞4次，以除去未结合的抗体，收集压积红细胞并留取约Iml的最后一次洗涤液。配置酸放散液：取4体积的放散液A与1体积的放散液B混合均匀。将Iml待检压积红细胞与Iml酸放散液混合均匀，室温孵育12分钟。以3000rpm离心1分钟取出上清液。上清液中加入中和液（5001上清液加入中和液8085l）,此时PH近中性。以300OrPnl离心12分钟，取上清即放散液，用放散液与指示细胞“Ac”“Be”“0c”反应，参照抗球蛋白试验检测项目标准操作规程8.9患儿红细胞抗体释放试验意义指示红细胞意义AcBe0十-释放出IgG抗A+释放出IgG抗B抗体+一（可能包括抗A或抗B）释放出IgG抗-A,B抗体+/-+/-十释放出A.B.0血型以外的抗体未释放出抗体8.10新生儿溶血病结果判定实验项目ABO-HDN可疑ABO-HDN非ABO.HDN直接抗球蛋白试验十I-游离抗体检查十十释放试验十十ABO系新生儿溶血病患儿红细胞上结合抗体较少，直抗试验常常得到阴性结果，所以直抗试验只起参考作用，而游离试验和释放试验都是新生儿溶血病的重要证据。ABO系以外新生儿溶血病直抗试验、游离试验和释放试验都是新生儿溶血病的重要证据。